李玉杰，吳登強(qiáng)，韋常宏，楊雪佳，周素芳

1廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2長(zhǎng)壽與老年相關(guān)疾病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3廣西高校生物分子醫(yī)學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，4區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧530021

肝癌是我國(guó)發(fā)病率第3位的惡性腫瘤，5年生存率僅為10%左右。據(jù)統(tǒng)計(jì)我國(guó)約有HBV 感染者1.2 億，占我國(guó)總?cè)丝诘?.09%，其中有1/4 是慢性乙肝患者［1,2］。目前可用的抗病毒藥物不能完全消除慢性乙型肝炎病毒。慢性HBV感染可導(dǎo)致肝臟慢性炎癥，導(dǎo)致正常肝細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞，使乙肝病毒成為重要的環(huán)境致癌物［3-5］。因此，為了提高患者的存活率，迫切需要有效的生物標(biāo)志物。近十年來(lái)，隨著全基因組基因表達(dá)芯片的廣泛應(yīng)用，基于基因表達(dá)譜檢測(cè)出了多種分子標(biāo)記，其中有幾種已用于肝癌的臨床治療。這些標(biāo)記物在早期診斷、分子分型、化療敏感性和耐藥性、預(yù)后預(yù)測(cè)和監(jiān)測(cè)等方面具有重要價(jià)值［6,7］。這些技術(shù)是分析海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)集的極佳選擇，以便深入解釋HCC的機(jī)制。目前，利用生物信息學(xué)方法可以識(shí)別與腫瘤消退相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物和信號(hào)通路。到目前為止，在大樣本的基礎(chǔ)上，還沒(méi)有足夠的生物信息學(xué)研究聚焦于HBV感染患者的HCC組織和非腫瘤組織之間的差異表達(dá)基因（DEGs），HBV促進(jìn)HCC發(fā)生的確切分子機(jī)制還不完全清楚，相關(guān)生物標(biāo)志物眾多，無(wú)法為臨床預(yù)后提供有針對(duì)性的依據(jù)［8］。迫切需要對(duì)相關(guān)的全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的全面基因組分析［9,10］。因此，利用生物信息學(xué)分析，可以通過(guò)識(shí)別hub基因（與其他基因有大量相互作用，通常在信號(hào)通路和生物學(xué)過(guò)程中起重要作用的基因）來(lái)闡明HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌的潛在分子機(jī)制，從而有助于開(kāi)發(fā)有效的新的診斷和治療策略。在本研究中，為了增加樣本量，我們整合了從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得的3個(gè)數(shù)據(jù)集，使用一個(gè)大的隊(duì)列，確定了HBV相關(guān)肝癌組織和非腫瘤組織之間的DEGs。并試圖利用生物信息學(xué)分析來(lái)識(shí)別hub基因和通路，篩選HBV感染誘導(dǎo)的肝癌的潛在治療靶點(diǎn)。

1 資料和方法

1.1 來(lái)自GEO的公開(kāi)數(shù)據(jù)

基于GPL570 平臺(tái)的3 個(gè)微陣列數(shù)據(jù)集（［HGU133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array）來(lái) 自GEO（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）［11］.GSE55092 數(shù)據(jù)集包含49個(gè)HBV相關(guān)的HCC組織樣本和91個(gè)HBV感染樣本，GSE121248數(shù)據(jù)集包含70個(gè)HBV相關(guān)的HCC組織樣本和37個(gè)HBV感染樣本，GSE84044數(shù)據(jù)集包含124個(gè)HBV感染樣本。所有原始數(shù)據(jù)（CEL）均從GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)下載。使用Robust Multichip Average 調(diào)整背景的原始文件。探針集注解可在affymetrix 官網(wǎng)（http://www.affymetrix.com/support/technical/annotationfilesmain.affx）下 載，“sva”R包用于消除批間差。

1.2 篩選DEGs

使用基于未配對(duì)t檢驗(yàn)的R 包“affy”（https://biocon-ductor.org/packages/affy/）鑒定HBV 相關(guān)HCC組織和非腫瘤HBV相關(guān)組織之間的DEG；閾值為|log2（fold change）|≥1.5，調(diào)整后的P<0.01。DEG由使用R包“gplots”（https://bioconductor.org/packages/gplots/）的熱圖表示。

1.3 DEGs的功能和通路富集分析

用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(kù)（DAVID,https://DAVID.ncifcrf.gov/home.jsp）是基于GO（http://www.geneontology.org）和KEGG（https://www.kegg.jp/）［12-15］。DEG分為3大類(lèi)：生物過(guò)程（BP）、細(xì)胞成分（CC）和分子功能（MF）。通路分析應(yīng)用于KEGG通路富集。

1.4 PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與模塊分析

檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具（https://string-db.org/.11.0版）是一種用于識(shí)別DEG相互作用和功能關(guān)聯(lián)的系統(tǒng)，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。在Cytoscape（https://cytoscape.org/）上，CytoHubba插件用于獲取在PPI 網(wǎng)絡(luò)上得分最高的前10 個(gè)PPI hub 基因。

1.5 遺傳標(biāo)記的生存分析和臨床特征

使用cBioPortal（http://www.cbioportal）分析關(guān)鍵基因之間的相關(guān)性。使用Oncomine 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.oncomine.org/）驗(yàn)證遺傳標(biāo)記的表達(dá)水平，該數(shù)據(jù)庫(kù)是具有基于網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)挖掘平臺(tái)的微陣列癌癥數(shù)據(jù)庫(kù)，以支持全基因組表達(dá)的分析。數(shù)據(jù)集按癌癥類(lèi)型（肝癌）和分析類(lèi)型（癌癥與正常）進(jìn)行過(guò)濾。使用UALCAN 在線分析工具（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）對(duì)遺傳標(biāo)記進(jìn)行預(yù)后分析，該工具結(jié)合了來(lái)自TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的預(yù)后數(shù)據(jù)。Kaplan-Meier plotter（http://kmplot.com/analysis）是一個(gè)開(kāi)源癌癥大數(shù)據(jù)分析網(wǎng)站，提供生存生物標(biāo)志物的在線驗(yàn)證并分析具有樞紐關(guān)鍵基因的患者的總生存期（OS）。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄定量（RT-q）PCR

2018年5月～2020年9月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院進(jìn)行的手術(shù)后，總共獲得了17個(gè)HCC 組織和17個(gè)配對(duì)的相鄰非腫瘤組織（表1）。所有組織在用于實(shí)驗(yàn)前均獲得患者同意。本研究經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，符合廣西醫(yī)科大學(xué)的倫理指南和規(guī)定。FFPE RNA分離試劑盒（Omega Bio-Tek,Inc.）。根據(jù)制造商的方案，使用PrimeScript RT-qPCR 試劑盒（Takara Bio,Inc.）獲得互補(bǔ)（c）DNA。使用GoTaq qPCR Master Mix 和SYBR green I（Takara Bio,Inc.）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將mRNA 表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為ACTB。細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1（CDK1）、細(xì)胞周期蛋白B1（CCNBI）和核分裂周期蛋白80（NDC80）的引物序列如下：CDK1 正向5'-AGC CGC CCT TTC CTC TTT CTT TC-3'和反向5'-CGG ATT CAC CAA TCG GGT AGC C-3'；CCNB1正向5'-GCC AGT GCC AGA GCC AGA AC-3'和反向5'-CAT TGG GCT TGG AGA GGC AGT ATC-3'；NDC80 正 向5'-GTG CCA GTG AGC TTG AGT CCT TG-3'和反向5'-CGT CTT TCT TCA GTC GTG GTT TGC-3'；ACTB 正 向5'-AGG TCG GTG TGAACG GAT TTG-3'和反向5'-GGGGTCGTTG ATGGCAACA-3'（Sangon Biotech）。

表1 17例樣本的基本臨床信息Tab.1 Basic clinical information of 17 patients with HCC

PCR熱循環(huán)條件如下：95 ℃初始變性30 s，95 ℃5 s和60 ℃34 s 40個(gè)循環(huán)。對(duì)于每個(gè)樣品，在20μL反應(yīng)體積中進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，其中包含2 μL 稀釋的cDNA、1.6 μL 正向和反向引物、10 μL SYBR Premix Ex Taq?（Takara Bio）和0.4μL ROX II Reference染料（Takara Bio）。CDK1、CCNB1 和NDC80 與ACTB 的相對(duì)表達(dá)使用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用R-3.6.3和SPSS22.0（IBM Corp.）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)和Fisher's精確檢驗(yàn)，連續(xù)資料比較采用t檢驗(yàn)，繪制Kaplan-Meier曲線，并進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)以評(píng)估患者生存。P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEGs的分析

在3個(gè)數(shù)據(jù)集（GSE55092、GSE121248 和GSE84044）中，其中119個(gè)為HBV相關(guān)的HCC 組織，其中252個(gè)為HBV 相關(guān)的組織。整合了3個(gè)數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析并去除批間差效應(yīng)（圖1A）?？偣泊_定了121個(gè)DEG，其倍數(shù)變化閾值>1.5 或<-1.5，調(diào)整后的P<0.01。圖1B中提供了DEG的熱圖。

圖1 去除微陣列數(shù)據(jù)中的批間差效應(yīng)和DEG表達(dá)譜熱圖的構(gòu)建Fig.1 Adjustment of batch effects in microarray expression data and heatmap of the expression profiles for the differentially expressed genes (DEGs).A:Removing the batch effects.B:Hierarchical clustering heatmaps of the DEGs screened on the basis of log|FC|>1.5 and a corrected P<0.01.The colors represent the expression level of the genes,and the higher the expression level,the darker the color(red,upregulated;green,downregulated).

2.2 DEGs的富集分析

記錄了富集分析的前10個(gè)結(jié)果（圖2）。BP 類(lèi)別中顯著富集的GO功能是氧化還原過(guò)程、外源藥物分解代謝過(guò)程和環(huán)氧化酶P450 途徑。MF類(lèi)別中顯著富集的GO功能是血紅素結(jié)合、鐵離子結(jié)合和氧化還原酶活性，作用于成對(duì)的供體，結(jié)合或還原分子氧。CC類(lèi)別中顯著富集的GO功能是細(xì)胞外區(qū)域、細(xì)胞器膜和中間體。對(duì)于KEGG通路，基因主要富集在視黃醇代謝、代謝通路和咖啡因代謝中。

圖2 DEG 的GO 和KEGG 通路富集分析Fig.2 GO and KEGG pathway enrichment analyses of the DEGs.A:Biological process (BP).B:Cellular component(CC).C:Molecular function (MF).D:KEGG pathway analysis.a:Oxidation-reduction process;b:Exogenous drug catabolic process;c:Epoxygenase P450 pathway;d:Drug metabolic process;e:Regulation of attachment of spindle microtubules to kinetochore;f:Xenobiotic metabolic process;g:Steroid metabolic process;h:Gluconeogenesis;i:Cellular response to calcium ion;j:Androgen metabolic process.

2.3 Hub基因的分析

構(gòu)建一個(gè)包含112個(gè)節(jié)點(diǎn)和231連接線的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）。然后，使用來(lái)自Cytoscape的CytoHubba應(yīng)用程序識(shí)別DEG 的中心基因（圖3B）。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中，得到了10個(gè)節(jié)點(diǎn)和44連接線；這些節(jié)點(diǎn)代表10個(gè)基因：細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶1（CDK1）、細(xì)胞周期蛋白B1（CCNBI）、核分裂周期80（NDC80）、拓?fù)洚悩?gòu)酶（DNA）II α 170 000（TOP2A）、上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化序列2癌基因（ECT2）、細(xì)胞周期相關(guān)蛋白激酶2（NEK2）、肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ANLN）、泛素蛋白連接酶同源物（DTL）、核糖核苷酸還原酶M2（RRM2）和透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)因子受體重組蛋白（HMMR）。同時(shí)，CDK1、CCNBI和NDC80是基于相互作用得分的前3個(gè)優(yōu)秀基因。

圖3 DEGs與前10個(gè)關(guān)鍵基因之間的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建Fig.3 Protein-protein interaction (PPI) network among the DEGs and the top 10 hub genes.A:PPI network.Circles represent genes,lines represent the interaction of proteins between genes,and the results within the circle represent the structure of proteins.Line colors indicate the interaction between the proteins.B:The most significant module was obtained from the PPI network of DEGs using CytoHubba,including 112 nodes and 231 edges.

2.4 Hub基因在HCC患者中的預(yù)后意義

在Wurmbach肝臟數(shù)據(jù)集中，3個(gè)hub基因顯著相關(guān)（圖4A）。根據(jù)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)（圖4B～D），3個(gè)關(guān)鍵基因的CDK1、CCNB1和NDC80之間存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。Pearson 和spearman 得分均超過(guò)0.8。在Wurmbach肝臟數(shù)據(jù)集中，3個(gè)hub基因顯著相關(guān)（圖4A）。根據(jù)cBioPortal 數(shù)據(jù)庫(kù)（圖4B～D），3 個(gè)關(guān)鍵基因的CDK1、CCNB1和NDC80之間存在顯著相關(guān)性（P<0.05）。Pearson和spearman得分均超過(guò)0.8。

圖4 hub基因與表達(dá)的相關(guān)性Fig.4 Correlation among the 3 hub genes and their expressions.A-D:Correlations between CDK1,CCNB1 and NDC80 in HCC.

在TCGA數(shù)據(jù)集中，CDK1、CCNB1和NDC80在肝細(xì)胞癌中的mRNA 表達(dá)明顯高于鄰近組織（圖5A～C）。此外，Oncomine數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析正常、肝硬化、肝細(xì)胞癌和肝細(xì)胞發(fā)育不良條件下hub 基因的表達(dá)（圖5D～F）。正常、肝硬化和肝細(xì)胞發(fā)育不良之間沒(méi)有顯著差異，但在HCC中表達(dá)顯著增加。在篩選了3個(gè)hub基因后，我們?cè)贙aplan-Meier繪圖儀中對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行了OS分析。結(jié)果表明，這些hub基因的突變可能導(dǎo)致HCC 患者的OS較差，表明這些基因具有潛在的診斷價(jià)值（圖5G～I(xiàn)）。隨后，使用Oncomine，在四個(gè)不同的數(shù)據(jù)集中，我們還發(fā)現(xiàn)hub基因的表達(dá)在腫瘤組織中顯著上調(diào)（圖6A～C）。

圖5 hub基因在不同類(lèi)型肝組織中的表達(dá)及CDK1、CCNB1和NDC80的ROC分析Fig.5 Expressions of CDK1,CCNB1 and NDC80 in different types of liver tissues and ROC analysis.A-C:Validation of the expression of the 3 genes at the mRNA and protein levels by the UALCAN database.D-F:Expression of CDK1,CCNB1 and NDC80 in normal,cirrhotic,HCC and hepatic dysplasia tissues in the Wurmbach liver dataset.G-I:Overall survival analyses of the hub genes using Kaplan–Meier Plotter online platform.

2.5 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

在17例肝癌中，CDK1、CCNB1和NDC80的表達(dá)明顯高于其配對(duì)的鄰近組織（P<0.001；圖7A～C）。此外，CCNB1與NDC80的表達(dá)呈高度正相關(guān)（P<0.001），而CDK1與CCNB1的表達(dá)與CDK1與NDC80的表達(dá)呈中度正相關(guān)（P<0.05；圖7D～F）。

圖7 驗(yàn)證hub基因在臨床樣本中的表達(dá)Fig.7 Verification of the expression of the hub genes in clinical samples of HCC.A:CDK1.B:CCNB1.C:NDC80.***P<0.001 vs adjacent tissues(n=17).D-F:CDK1,CCNB1 and NDC80 expressions levels were highly correlated with one another(n=17).

3 討論

肝癌的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程［16,17］。近年來(lái)，大量生物標(biāo)志物被用于肝癌的早期診斷，尤其是慢性乙型肝炎病毒（HBV）［18-20］，它是HCC的重要病因之一［21,22］。此外，本研究主要針對(duì)HBV感染患者，這與以往研究?jī)H針對(duì)HCC患者有所不同。盡管一些研究使用了與本研究相似的數(shù)據(jù)集，但得到了不同的結(jié)果。首先，本研究使用“sva”包去除批次效應(yīng)，減少分析誤差，使用不同插件分析hub 基因［23,24］，本研究篩選出HBV-通過(guò)檢查GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的3個(gè)芯片數(shù)據(jù)集來(lái)關(guān)聯(lián)HCC和正常組織。為了避免每個(gè)數(shù)據(jù)集在測(cè)量平臺(tái)和實(shí)驗(yàn)室條件下的差異，我們使用“sva”包來(lái)消除批間差效應(yīng)。在371份HBV陽(yáng)性樣本中，與非腫瘤肝組織相比，在HCC組織中共鑒定出121個(gè)DEG。KEGG分析表明，DEG富含代謝途徑，如視黃醇代謝、咖啡因代謝和藥物代謝-細(xì)胞色素P450。這些結(jié)果表明，DEGs顯著影響細(xì)胞分裂和代謝途徑。氧化還原過(guò)程、外源性藥物分解代謝過(guò)程和紡錘體微管與動(dòng)力連接的調(diào)節(jié)是前3個(gè)最顯著富集的BP。所有這些BP術(shù)語(yǔ)在維持生物體的正常生長(zhǎng)和代謝方面都發(fā)揮著重要作用。

最后，表明10 個(gè)基因CDK1、CCNB1、NDC80、TOP2A、NEK2、ECT2、ANLN、DTL、RRM2、HMMR與癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活有關(guān)。據(jù)報(bào)道，TOP2A 可以在許多癌癥類(lèi)型中誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展。目前大多數(shù)研究表明，異常TOP2A表達(dá)誘導(dǎo)腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥等惡性特征主要是通過(guò)DNA拓?fù)錉顟B(tài)的調(diào)節(jié)和復(fù)制。此外，TOP2A是一些最廣泛使用的用于治療人類(lèi)癌癥的化療藥物的靶點(diǎn)［25,26］。NEK2通過(guò)其底物C-NAP1的可逆磷酸化調(diào)節(jié)有絲分裂中心體分離，在維持中心體完整性方面發(fā)揮著重要作用。癌細(xì)胞中過(guò)度暴露NEK2導(dǎo)致CIN、細(xì)胞增殖和耐藥性增強(qiáng)［27,28］。最近的一項(xiàng)研究還表明ECT2與早期復(fù)發(fā)性HCC疾病和較差的生存率顯著相關(guān)。敲除ECT2可顯著抑制Rho家族的小分子鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶（Rho GTPases）的活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，減弱致癌性并降低HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力［29,30］。ANLN缺乏誘導(dǎo)多核細(xì)胞數(shù)量增加，同時(shí)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)和DNA損傷檢查點(diǎn)。此外，HBV感染通過(guò)抑制microRNA（miR）15a和miR 16 1的表達(dá)增加了ANLN的表達(dá)，這兩個(gè)都通過(guò)靶向其3個(gè)非翻譯區(qū)而被鑒定為ANLN 上游阻遏物。ANLN 通過(guò)減少細(xì)胞凋亡和DNA損傷的方式促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。ANLN的表達(dá)水平顯著影響HCC患者的生存概率，可能代表一個(gè)有前景的預(yù)后生物標(biāo)志物［31］。據(jù)報(bào)道，靶向DTL減少了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和染色體分離基因，導(dǎo)致細(xì)胞微核化增加。DTL耗竭抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增加衰老和減少腫瘤發(fā)生［32,33］。據(jù)報(bào)道，RRM2是索拉非尼的新靶點(diǎn)，部分有助于其在HCC細(xì)胞中的抗癌活性［34］。

KEGG分析顯示，“視黃醇代謝”、“咖啡因代謝”和“p53信號(hào)通路”的富集程度最高，表明DEGs顯著影響細(xì)胞分裂和代謝通路，促進(jìn)晚期復(fù)合物依賴(lài)性分解代謝過(guò)程、氧化還原過(guò)程和細(xì)胞是前3個(gè)具有最顯著富集的BP。腫瘤發(fā)生的主要原因可能是細(xì)胞周期失衡，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。以前的研究報(bào)道，HBV感染可引起代謝信號(hào)通路的變化。結(jié)果可能會(huì)改變正常的肝細(xì)胞代謝并促進(jìn)HBV相關(guān)HCC的進(jìn)展。

除上述關(guān)鍵基因外，本研究重點(diǎn)關(guān)注CDK1、CCNB1和NDC80基因。CDK1與較差的HCC 總生存率相關(guān)（P=0.008）。CDK1高表達(dá)是1年和5年腫瘤復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素（P=0.013和P=0.017），表明CDK1可能在HCC進(jìn)展中發(fā)揮重要的致癌作用［35］。CDK1是Serd/Thr 蛋白激酶的成員，對(duì)細(xì)胞G1/S和G2/M相變至關(guān)重要［36-38］。機(jī)制研究表明FOXM1直接結(jié)合CCNB1的啟動(dòng)子區(qū)域并調(diào)節(jié)表達(dá)水平CCNB1 基因的轉(zhuǎn)錄水平。CCNB1的高表達(dá)與HCC患者的不良預(yù)后密切相關(guān)［39-41］。在既往研究中，HCC組織中NDC80的表達(dá)水平顯著高于鄰近組織。NDC80的組合式導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加和S期細(xì)胞周期停滯。NDC80通過(guò)減少細(xì)胞凋亡和克服細(xì)胞周期停滯來(lái)促進(jìn)HCC 進(jìn)展［42］。在本研究中，使用TCGA數(shù)據(jù)的進(jìn)一步分析表明CDK1、CCNB1和NDC80之間存在密切相關(guān)性。HBV相關(guān)肝癌中3個(gè)hub基因的表達(dá)明顯高于鄰近組織。肝癌患者的生存率顯著相關(guān)。CDK1、CCNB1和NDC80在HCC組織中的高表達(dá)與預(yù)后不良和高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。然而，這3個(gè)基因在肝癌和其他癌癥類(lèi)型中的生物學(xué)功能，包括代謝和細(xì)胞周期，需要進(jìn)一步研究。這可能表明它們作為治療肝癌或其他癌癥類(lèi)型的靶標(biāo)的效用，并提供有關(guān)它們相互作用的詳細(xì)信息。

總之，通過(guò)基因組水平和生物信息學(xué)分析，本研究確定了與肝癌發(fā)生有關(guān)的DEGs，同時(shí)，PPI網(wǎng)絡(luò)也揭示了DEGs在這些通路中的相互作用，并最終確定了3個(gè)基因標(biāo)志物。只有少數(shù)研究集中在3個(gè)基因之間的聯(lián)系，本研究試圖做到這一點(diǎn)，一些結(jié)果與先前的研究一致，但NDC80與肝癌的關(guān)系鮮少被報(bào)道，以后的研究應(yīng)該重點(diǎn)關(guān)注。雖然這些數(shù)據(jù)集在之前的研究中已經(jīng)部分使用，但本研究不同于之前的研究［10,23,43,44］，本文綜合運(yùn)用了3個(gè)數(shù)據(jù)集，而不是直接線上分析，相比之前的研究，增加了R包去除批間差效應(yīng)，大大降低了外界因素導(dǎo)致的分析誤差，而且，此研究不僅僅停留于分析層面，并收集臨床樣本進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)采集的17對(duì)臨床樣本進(jìn)行了RT-qPCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果表明與分析一致。本研究為有HBV感染史的患者提供了HCC的新病因和非腫瘤肝組織轉(zhuǎn)化為HCC組織的分子機(jī)制。重要的是，這些結(jié)果可能為這些患者的靶向治療提供一些潛在的治療靶點(diǎn)，有助于肝癌的早期診斷和治療。