王超，音金萍，卓少元

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200）

肝臟是人體最主要的藥物代謝器官。在藥物使用過(guò)程中，因藥物本身或/及其代謝產(chǎn)物或由于特殊體質(zhì)對(duì)藥物的超敏感性或耐受性降低所導(dǎo)致的肝臟損傷稱為藥物性肝損傷（drug induced liver injury，DILI）。據(jù)臨床病例統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示［1-2］，中草藥是導(dǎo)致DILI的重要原因之一。健脾益氣方是本課題組根據(jù)肝癌臨床和相關(guān)文獻(xiàn)研究歸納總結(jié)出的基本方，主要對(duì)應(yīng)臨床肝癌脾氣虛弱的基本證型；前期研究發(fā)現(xiàn)該方不僅可以延長(zhǎng)DEN（二乙基亞硝胺）肝癌大鼠生存率、降低肝細(xì)胞炎性壞死和肝癌組織癌基因表達(dá)的作用［3-4］，而且能夠通過(guò)調(diào)控肝癌炎癥微環(huán)境抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［5-7］。但是健脾益氣方在治療肝癌過(guò)程中對(duì)正常肝臟是否有保護(hù)作用尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論進(jìn)行綜合網(wǎng)絡(luò)分析，已廣泛應(yīng)用于中藥的機(jī)制研究［8-10］。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接技術(shù)分析健脾益氣方通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)防治急性肝損傷（ALI）的潛在靶標(biāo)，并利用D-GalN所致的ALI模型，觀察健脾益氣方干預(yù)對(duì)ALI大鼠肝組織形態(tài)、損傷指數(shù)、Nod樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NLRP3）炎性小體活化通路等的影響，探討其保肝的可能性，以期為該方的臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接涉及的主要數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件有TCMSP（https：//www.tcmsp-e.com/）、PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swis?stargetprediction.ch/）、Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/omim）、String數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/）、PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）和Cytoscape3.8.2軟件、Autodock 4.2軟件、Pymol 2.5軟件。

1.2 動(dòng)物SPF級(jí)SD大鼠30只，雄性，8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002，生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK（湘）2014-0012，質(zhì)量合格證號(hào)：43004700040620，動(dòng)物倫理審查證書編號(hào)：DW20210328-049。采取標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.3 藥物及試劑健脾益氣方由七味中藥組成（黃芪30 g、白術(shù)10 g、薏苡仁15 g、白芍15 g、神曲10 g、茯苓15 g、法半夏10 g），購(gòu)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。健脾益氣方按處方稱量藥材，加10倍量蒸餾水浸泡1 h，第一次煎煮1.5 h，再次加入8倍量蒸餾水煎煮1 h，合并兩次濾液，濃縮配制成1 g/ml的藥液，過(guò)濾除菌分裝，4℃保存?zhèn)溆?。D-GalN（純度>99%，美國(guó)Sig?ma-Aldrich公司，批號(hào)#SLBT9951）；ALT和AST測(cè)定試劑盒（長(zhǎng)春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為20181010、20181012）；GGT測(cè)定試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20181013）；大鼠IL-1β、IL-18和NF-κB酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)分別為T19018385、6S5915PQSP、QKZAQ7RBK1）；大鼠Caspase-1活性測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)20190314）；ASC單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotecnology公司，批號(hào)#J1518）；β-Actin抗體（北京博奧森生物，批號(hào)A108282882）；NLRP3抗體（英國(guó)Abcam公司，批號(hào)B-3）；山羊抗兔的二抗和山羊抗鼠的二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為00081002、00062578）。

1.4 儀器Epoch Biotek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；Chemray全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Rayto公司）；倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；ST 16R高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher公司）；搖床（上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；電泳儀和全能型成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 健脾益氣方治療急性肝損傷潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型構(gòu)建通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)以及文獻(xiàn)檢索，收集到健脾益氣方中黃芪、白芍、白術(shù)、薏苡仁、半夏、茯苓的有效成分。TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)未收錄神曲的有效成分，故通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲取［11-12］。利用口服利用度OB≥30%和藥物相似性DL≥0.18為條件篩選以上7味中藥的有效成分。將篩選到的有效成分在PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)中找到對(duì)應(yīng)的SMILES編號(hào)，利用Swiss Target Prediction對(duì)有效成分的靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到健脾益氣方活性成分的靶點(diǎn)。通過(guò)在Gene Cards數(shù)據(jù)庫(kù)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索“acute liver injury，inflammation，immunoregula?tion”，將急性肝損傷、炎癥和免疫調(diào)節(jié)三者的靶點(diǎn)取交集并用Uniprot ID進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化得到疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)和健脾益氣方活性成分靶點(diǎn)取交集去重得到健脾益氣方通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)防治ALI的潛在靶點(diǎn)。用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建健脾益氣方-活性成分-疾病靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，用Cytoscape 3.8.2進(jìn)行可視化分析。

2.2 主要活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中下載活性成分結(jié)構(gòu)的mol2格式文件，在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索靶點(diǎn)分子的PDB格式文件，用Pymol軟件去除配體。用Autodock 4.2軟件進(jìn)行分子對(duì)接，將對(duì)接結(jié)果用Pymol軟件可視化并輸出。

2.3 動(dòng)物分組、模型復(fù)制與給藥將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為5組：正常組、模型組和健脾益氣方低、中、高劑量組（JP-L組、JP-M組、JP-H組），每組6只。其中，模型組和JP-L組、JP-M組、JP-H組大鼠均按600 mg/kg一次性腹腔注射D-GalN復(fù)制ALI模型；正常組大鼠按600 mg/kg一次性腹腔注射生理鹽水。造模后JP-L組、JP-M組、JP-H組分別按成人用藥量的3、6、12倍立即給予健脾益氣方灌胃，即5.25 g/kg、10.5 g/kg、21 g/kg（將成人每日口服生藥量折算成大鼠等效劑量作為中劑量組用量：大鼠中劑量用藥=成人每日口服生藥量÷60 kg×6=10.5 g/kg［13］），每日2次，連續(xù)給藥2 d。正常組和模型組大鼠以10.5 g/kg的生理鹽水灌胃。各組大鼠均于末次給藥后1 h內(nèi)用3%戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血分離血清，取完整肝臟組織。

2.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察取肝臟組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察各組肝臟組織病理學(xué)變化。

2.5 血清生化指標(biāo)與炎癥因子含量檢測(cè)采用生化法檢測(cè)大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）的含量；采用ELISA檢測(cè)血清中白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素18（IL-18）和核因子κB（NF-κB）的含量。以上步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。

2.6 肝臟組織NLRP3和凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）的蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)用WB法檢測(cè)肝臟組織中NLRP3和ASC蛋白表達(dá)水平。取肝臟組織20 mg，加入裂解液冰上裂解、提取蛋白，按BCA法測(cè)定蛋白含量。經(jīng)SDS-PAGE電泳后冰浴轉(zhuǎn)膜，TBST洗滌3次，封閉液封閉1.5 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜（稀釋倍數(shù)β-Actin為1∶1 000，ASC為1∶400，NLRP3為1∶1 000），洗滌同上，加入二抗室溫孵育1 h（稀釋倍數(shù)為1∶3 000），采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，用全能型成像分析系統(tǒng)采集照片。

2.7 肝組織中半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（Caspase-1）活性檢測(cè)取肝臟組織加裂解液冰上裂解提取總蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度到1 mg/ml。按照Caspase-1活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析（one-way ANO?VA），非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 健脾益氣方治療ALI的潛在靶點(diǎn)分析通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，篩選得到79個(gè)健脾益氣方的活性成分，預(yù)測(cè)到834個(gè)活性成分的靶點(diǎn)。通過(guò)Gene Cards與OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索到與急性肝損傷、炎癥以及免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的基因靶點(diǎn)取交集去重后有107個(gè)，與健脾益氣方活性成分預(yù)測(cè)的834個(gè)靶點(diǎn)取交集后得到39個(gè)健脾益氣方治療ALI的潛在靶點(diǎn)。將中藥、活性成分、靶點(diǎn)構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。健脾益氣方有68個(gè)活性成分直接參與到網(wǎng)絡(luò)圖中。將39個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯▓D2），涉及33個(gè)節(jié)點(diǎn)，151條邊。節(jié)點(diǎn)表示基因，大小表示degree值；邊表示基因間的作用關(guān)系，粗細(xì)表示Combine score大小。這些基因的分子功能主要有磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性等；涉及的KEGG代謝通路主要有乙肝病毒相關(guān)、Toll樣受體信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路等。主要涉及MAPK、IL-6/STAT3、NLRP3/IL-1β等多條信號(hào)通路。結(jié)合前期研究結(jié)果本研究主要圍繞NLRP3/IL-1β通路相關(guān)分子（如NLRP3、IL-1β、RELA/NF-κB p65）進(jìn)行分子對(duì)接和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在圖2中以黃色圓圈所示。

圖1 健脾益氣方治療急性肝損傷的“藥物-成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

圖2 健脾益氣方通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)治療急性肝損傷的潛在靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

3.2主要活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接選擇在“藥物-成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中degree值較高的3個(gè)活性成分與NLRP3、IL-1β、RELA進(jìn)行分子對(duì)接。對(duì)接的最低自由能越低，提示蛋白與配體之間結(jié)合活性越好。分子對(duì)接結(jié)果顯示，選取的3個(gè)活性成分與NLRP3、IL-1β、RELA均能夠有效結(jié)合，結(jié)合的最低自由能均小于-5（表1）。將每個(gè)蛋白與配體結(jié)合有最低結(jié)合能的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化處理，見(jiàn)圖3。

表1 主要活性成分與靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)合能

圖3 主要活性成分與靶點(diǎn)的對(duì)接模式圖

3.3 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響肉眼觀察及HE染色結(jié)果（見(jiàn)圖4）可見(jiàn)：正常組大鼠肝臟顏色鮮紅、邊緣扁尖銳利、質(zhì)地柔軟、表面光滑無(wú)任何異常；肝小葉的結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細(xì)胞排列成條索狀，以中央靜脈為中心向四周放射。模型組大鼠肝臟色澤晦暗伴有粘連，部分位置有出血，可見(jiàn)白色小點(diǎn)或白色壞死病灶，部分大鼠肝臟變大；肝小葉結(jié)構(gòu)破壞明顯，肝血竇充血，肝細(xì)胞多處成點(diǎn)狀壞死，肝細(xì)胞核消失，壞死灶內(nèi)有大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。健脾益氣方治療后，低劑量組大鼠除肝血竇充血減少外，其它與模型組相似；中劑量組大鼠肝臟形態(tài)基本正常，色澤較紅，質(zhì)地較柔軟，無(wú)明顯病變；高劑量組大鼠肝臟體積稍大，個(gè)別表面呈細(xì)小顆粒狀，無(wú)出血現(xiàn)象。健脾益氣方中、高劑量組大鼠肝細(xì)胞損傷及炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度較輕。

圖4 肝臟一般情況及組織病理學(xué)比較（HE×400）

3.4 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清生化指標(biāo)含量的影響見(jiàn)表2。與正常組相比，模型組ALT、AST和GGT的含量均升高，其中ALT和AST的組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)健脾益氣方治療后，ALI大鼠血清中ALT、AST和GGT的含量均出現(xiàn)降低趨勢(shì)，且隨劑量的增加而含量逐漸降低。其中健脾益氣方中、高劑量組的ALT、AST、GGT與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；低劑量組的ALT與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表2 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清ALT、AST和GGT含量的影響 （±s）

表2 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清ALT、AST和GGT含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01

?

3.5 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響見(jiàn)表3。與正常組比較，模型組大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均升高；其中，IL-1β和NF-κB差異顯著（P<0.01）。經(jīng)健脾益氣方治療后，ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB的含量均出現(xiàn)降低趨勢(shì)，且隨劑量的增加而含量逐漸降低；除低劑量組的IL-1β外，其它各治療組血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表3 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響 （±s）

表3 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠血清IL-1β、IL-18和NF-κB含量的影響 （±s）

注：與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.05，③P<0.01

?

3.6 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織NLRP3、ASC蛋白表達(dá)水平的影響WB法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中NLRP3、ASC蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)圖5。與正常組比較，模型組大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，健脾益氣方各治療組大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.01），其中以中、高劑量組的效果最明顯。

圖5 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá)的影響

3.7健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響見(jiàn)表4。模型組大鼠肝組織Caspase-1酶活性明顯升高，是正常組的179.75倍。健脾益氣方治療后，低、中、高劑量組的Caspase-1酶活性均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表4 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響（±s）

表4 健脾益氣方對(duì)ALI大鼠肝組織Caspase-1酶活性的影響（±s）

注：與模型組比較，①P<0.05，②P<0.01

?

4 討論

合適的肝損傷動(dòng)物模型是篩選與評(píng)價(jià)保肝藥物的關(guān)鍵。在眾多的肝損傷模型中，D-GalN誘導(dǎo)的急性肝損傷被認(rèn)為是保肝新藥篩選與評(píng)價(jià)較理想的模型之一，但其合適的造模劑量存在一定的爭(zhēng)議［14-16］，根據(jù)以往研究結(jié)果，本研究選用600 mg/kg體重一次性腹腔注射D-GalN制備ALI模型。D-GalN與肝細(xì)胞內(nèi)的UDP結(jié)合，耗竭UTP，使肝細(xì)胞內(nèi)RNA、蛋白質(zhì)合成受阻，糖和磷脂代謝發(fā)生障礙，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞膜受損，引起肝細(xì)胞壞死，進(jìn)而使ALT、AST、GGT等酶入血，因此，血清中ALT、AST、GGT可以反映肝損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中ALT、AST、GGT含量均升高，并且ALT、AST差異顯著，結(jié)果顯示本研究成功復(fù)制了大鼠ALI模型。

健脾益氣方由七味中藥組成，以黃芪為君，白術(shù)、茯苓為臣，白芍、半夏、薏苡仁、神曲為佐，有補(bǔ)益正氣、健脾祛濕、散結(jié)消痞之功效。本研究結(jié)果顯示，健脾益氣方中、高劑量治療組均能改善急性肝損傷大鼠肝組織的病理變化，降低血清中ALT、AST、GGT含量（P<0.05或P<0.01），具有一定的保肝作用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)基于系統(tǒng)生物學(xué)的方法被提出并迅速發(fā)展，從整體和網(wǎng)絡(luò)角度描述藥物、生物系統(tǒng)和疾病之間的關(guān)系，對(duì)現(xiàn)代中醫(yī)藥尤其是復(fù)方的研發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)［8-10］。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法篩選得到健脾益氣方通過(guò)抗炎和免疫調(diào)節(jié)治療急性肝損傷的活性成分68個(gè)，潛在靶標(biāo)39個(gè)，這些潛在靶標(biāo)涉及到多個(gè)生物學(xué)過(guò)程、多種分子功能和KEGG代謝通路，提示健脾益氣方防治急性肝損傷是多途徑、多靶點(diǎn)的干預(yù)機(jī)制。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，本研究選取degree最高的前3個(gè)活性成分與得分較高的NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、ILIB、RELA進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示這3個(gè)成分與3個(gè)靶標(biāo)蛋白均有較高的結(jié)合活性，驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的結(jié)果。

NLRP3炎性小體（inflammasome）是由多種蛋白組成的復(fù)合物，主要由感受器蛋白NLRP3、銜接分子ASC（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）及效應(yīng)分子pro-caspase-1組成。多種刺激信號(hào)均可觸發(fā)NLRP3的激活，NLRP3招募并裂解procaspase-1；激活的Caspase-1可將pro-IL-1β和pro-IL-18切割成成熟的IL-1β和IL-18，使之分泌到細(xì)胞外發(fā)揮各種炎癥效應(yīng)［17］。NF-κB在細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，能夠誘導(dǎo)NLRP3炎性小體的活化［18］，且活化后的IL-1β還能利用其受體IL-1R1激活NF-κB［19］，從而形成“瀑布效應(yīng)”加重細(xì)胞炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠血清IL-1β、NF-κB含量，肝組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01），Caspase-1酶活性也明顯升高，進(jìn)一步提示模型大鼠肝功能受損及NLRP3炎性小體的激活。本研究結(jié)果還顯示中、高劑量的健脾益氣方能夠明顯降低模型大鼠血清IL-1β、IL-18、NF-κB含量，肝組織NLRP3和ASC蛋白表達(dá)水平，及肝組織Caspase-1酶活性（P<0.01）。提示健脾益氣方可能通過(guò)下調(diào)NLRP3炎性小體的活化從而抑制D-GalN致ALI大鼠中的炎癥反應(yīng)，從而起到保肝作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對(duì)接分析的結(jié)果一致。

綜上所述，健脾益氣方對(duì)D-GalN致急性肝損傷大鼠具有明顯的保護(hù)作用，其中以中、高劑量的健脾益氣方防治的效果為佳。該方可明顯降低血清GGT、ALT、AST含量，及肝臟組織損傷指數(shù)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)NLRP3炎癥小體的活化有關(guān)，但具體分子調(diào)控機(jī)制有待深入研究。