黃覃鳳，張永琴，梁麗英，楊繼峰，韋艾凌

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530200）

肝癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。據(jù)2020年美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)公布的癌癥數(shù)據(jù)顯示，肝癌患者病例數(shù)的增長(zhǎng)最為迅速，在2006年至2017年期間每年以2%～3%的速度增加［1］。與此同時(shí)，肝癌也是導(dǎo)致癌癥死亡的第三大原因［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中存在血管生成擬態(tài)（vasculogenic mimicry，VM），具有VM形成的肝癌較容易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，惡性程度高且預(yù)后較差。肝癌對(duì)人類的生命產(chǎn)生極大威脅，如何有效阻斷腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移是提高肝癌診治水平的關(guān)鍵。本課題組長(zhǎng)期致力于肝癌的中西醫(yī)結(jié)合防治研究，在國(guó)內(nèi)首次提出肝癌“瘀”“毒”“虛”新病機(jī)理論假說，并據(jù)此研制出癌痛消方應(yīng)用于臨床防治原發(fā)性肝癌，療效顯著［3］。

癌痛消方由白花蛇舌草、解毒草、煅牡蠣、延胡索、香附、三棱、黨參、半枝蓮、黃芪、莪術(shù)等組成，具有清熱解毒、化瘀散結(jié)、健脾益氣、行氣止痛之功效。本實(shí)驗(yàn)采用二氯化鈷（CoCl2）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株HepG2缺氧模型，觀察癌痛消方含藥血清對(duì)肝癌細(xì)胞VM成管能力的影響，采用蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)VM形成相關(guān)因子的表達(dá)水平，探討癌痛消方拮抗肝癌的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株人肝癌細(xì)胞株HepG2（由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫提供）。

1.2 動(dòng)物清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量250～300 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)/使用許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。動(dòng)物均飼養(yǎng)于室內(nèi)溫度（20～25℃）、相對(duì)濕度為55%～70%的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.3 藥物癌痛消方由白花蛇舌草20 g、解毒草20 g、三棱10 g、半枝蓮15 g、煅牡蠣30 g、香附10 g、黨參10 g、黃芪20 g、絞股藍(lán)12 g、莪術(shù)10 g、延胡索20 g、炙甘草10 g組成，制劑由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)中心配制，為癌痛消方的飽和溶液，濃度為1 g/ml（用藥劑量按人與動(dòng)物體質(zhì)量換算）。

1.4 試劑胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：25200-056）；RPMI 1640培養(yǎng)液（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：SV30010）；CoCl2（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：G7021）；兔抗HIF-1α多克隆抗體（美國(guó)Proteintech公司，批號(hào)：20960-1-AP）；兔抗VEGF多克隆抗體（美國(guó)Protein?tech公司，批號(hào)：19003-1-AP）；兔抗EphA2單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：6997S）；兔VE-cadherin單克隆抗體（美國(guó)Cell Signaling Tech?nology公司，批號(hào)：2500S）；鼠抗β-actin單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：TA-09）。

1.5 儀器DMI6000B型倒置熒光顯微鏡（德國(guó)，Lei?ca公司）；Forma 370二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；Mini-PROTEAN蛋白垂直電泳系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；Amersham Imager 600多功能成像儀（美國(guó)GE公司）。

2 方法

2.1 含藥血清的制備將SD大鼠隨機(jī)分成4組，每組6只。癌痛消方高、中、低劑量組分別按臨床劑量等效量的2倍、1倍、0.5倍（即10.8 g/kg、5.4 g/kg、2.7 g/kg）灌胃給藥，正常組予蒸餾水灌胃，每日2次，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥后2 h，以相同的劑量重復(fù)給藥1次，1 h后以戊巴比妥麻醉，75%酒精消毒，腹主動(dòng)脈取血，常溫中靜置2 h后3 000 r/min離心20 min，合并所得同組動(dòng)物血清，使用0.22 μm濾器過濾后即為癌痛消方含藥血清，經(jīng)56℃、30 min水浴的滅活操作后，置于-80℃冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)將HepG2接種于含10%胎牛血清、100 g/L青霉素、100 g/L鏈霉素的RPMI-1640完全培養(yǎng)液中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至單層后更換為含150μmol/L CoCl2的完全培養(yǎng)液，再培養(yǎng)24 h。

2.3 血管生成擬態(tài)結(jié)構(gòu)觀察將基質(zhì)膠（Matrigel）按每孔200 μl加入24孔板備用。培養(yǎng)HepG2至70%~80%融合，胰酶消化。加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，調(diào)整HepG2細(xì)胞濃度為1×105cell/ml，每孔取0.8 ml。加入不同濃度的癌痛消方含藥血清，置于37℃和5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。倒置熒光顯微鏡下觀察VM成管情況，拍照并獲取圖像。計(jì)算細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率，即一個(gè)視野里具有血管生成擬態(tài)功能細(xì)胞與所有細(xì)胞的百分比。

2.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，滴加RIPA裂解液，裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞的總蛋白；BCA法檢測(cè)總蛋白的濃度，滴加SDS-PAGE上樣緩沖液，經(jīng)10 min沸水浴后，按照50 μg的上樣量置于PAGE凝膠電泳分離目的蛋白。電泳結(jié)束后使用半干法（25 V恒壓45 min）將所得蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，再使用脫脂乳在室溫中封閉1 h。分別加入稀釋后的HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin抗體，4℃孵育過夜。TBST洗滌PVDF膜3次，每次5 min，隨后滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記（HRP）的山羊抗兔IgG抗體，37℃中孵育1 h。TBST洗滌3次后再使用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，拍照保存結(jié)果。使用Image J軟件計(jì)算各目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值，以所得兩者的灰度值比值作為蛋白表達(dá)量。每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，取平均值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及作圖，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間差異采用方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 癌痛消方對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的影響見圖1、圖2、表1。與正常組比較，癌痛消方各劑量組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率均明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01），說明癌痛消方各劑量組均可抑制肝癌VM的形成。

表1 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較（±s）

表1 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較（±s）

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

圖1 各組肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)顯微結(jié)構(gòu)（×40）

圖2 各組HepG2細(xì)胞血管生成擬態(tài)形成率比較

3.2 癌痛消方對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞中VM形成相關(guān)因子蛋白表達(dá)的影響見圖3、圖4、表2。與正常組比較，癌痛消方各劑量組HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平明顯下降，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05或P<0.01）。

圖3 Western blot檢測(cè)各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin蛋白的表達(dá)圖

圖4 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白的表達(dá)水平

表2 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

表2 各組肝癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF、VE-cadherin、EphA2蛋白表達(dá)水平比較 （±s）

注：與正常組比較，①P<0.05，②P<0.01

4 討論

肝癌為典型的富血管惡性腫瘤，高密度的血管形成不但是肝癌生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的誘因，而且還是肝癌組織營(yíng)養(yǎng)供給的主要途徑。VM作為不依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的管道，肝癌的組織可經(jīng)過這些血管和宿主的管道相連接，從而為肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及侵襲提供豐富的血供。腫瘤的快速增長(zhǎng)及血供量不足會(huì)導(dǎo)致微環(huán)境中出現(xiàn)缺氧，然而缺氧并未能阻止腫瘤的惡性增長(zhǎng)。缺氧狀態(tài)的短暫或是持久都可增加惡性腫瘤預(yù)后不佳的風(fēng)險(xiǎn)，即通過調(diào)節(jié)相關(guān)腫瘤細(xì)胞通路、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、誘導(dǎo)和維持腫瘤干細(xì)胞形成，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，同時(shí)還可以增加腫瘤細(xì)胞的耐藥性，促進(jìn)血管生成和VM［4］。劉文斌等［5］研究結(jié)果顯示，無論是常氧或缺氧狀態(tài)，肝癌細(xì)胞均能形成VM管道，但缺氧組的肝癌細(xì)胞所形成的管道長(zhǎng)度明顯比常氧組的長(zhǎng)，這說明缺氧微環(huán)境有利于肝癌VM的形成；同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)，在缺氧微環(huán)境下，伴隨VM管道的生成，缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-in-ducible factor，HIF-1α）可在缺氧條件下被明顯上調(diào)。HIF-1α作為主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可以上調(diào)其下游血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascularen?dothelial growth factor，VEGF）的轉(zhuǎn)錄［6］，從而促進(jìn)VM網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的形成［7］。VEGF還可以通過提高腫瘤血管的通透性，促使外滲的血漿蛋白增多，從而為VM的形成及新生血管生成提供暫時(shí)性基質(zhì)。此外，VEGF還能促進(jìn)促紅素人肝細(xì)胞受體酪氨酸激酶A2（Ephreceptor tyrosine kinase-type A2，EphA2）和血管內(nèi)皮鈣黏蛋白（vascular endothelial cadherin，VE-cadherin）的表達(dá)，從而促進(jìn)VM的形成［8］。

肝癌歸屬于中醫(yī)學(xué)“積聚”的范疇，中醫(yī)藥治療肝癌有著悠久的歷史，且療效顯著。大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究均證實(shí)，臨床經(jīng)驗(yàn)方在治療肝癌方面可改善患者的生活質(zhì)量，延長(zhǎng)生存時(shí)間，減毒增效，增強(qiáng)患者免疫力，緩解射頻消融術(shù)后常見的不良反應(yīng)等［9-10］。本課題組提出的肝癌“瘀”“虛”“毒”新病機(jī)理論假說認(rèn)為：癌毒是致病的始動(dòng)因素，毒濕結(jié)聚、氣血運(yùn)行不通是肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)，濕、瘀、熱為病理產(chǎn)物，虛既為病之因也為病之進(jìn)。癌痛消方正是基于此病因病機(jī)，在《醫(yī)林改錯(cuò)》的“膈下逐瘀湯”中加入臨床經(jīng)驗(yàn)用藥而形成的方劑。前期研究表明，該方治療肝癌及其術(shù)后復(fù)發(fā)者臨床療效確切，無明顯毒副作用［11］，且可抑制肝癌細(xì)胞的增殖并促使其凋亡［12］，抗腫瘤血管新生［13］。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，癌痛消方可明顯抑制肝癌細(xì)胞血管生成擬態(tài)的形成，能降低肝癌血管生成擬態(tài)相關(guān)因子HIF-1α、VEGF、EphA2、VE-cadherin的蛋白表達(dá)水平。本研究結(jié)果可為癌痛消方抗肝癌的臨床應(yīng)用提供新的科學(xué)依據(jù)。