蘇梅 婁雅靜 王姍 秦引林

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病簡(jiǎn)稱(chēng)冠心病，主要是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)脂肪沉積、斑塊形成，導(dǎo)致血管狹窄、阻塞，促使心肌缺氧缺血甚至壞死[1]。冠心病患者發(fā)病時(shí)，會(huì)因心肌急劇的暫時(shí)或持續(xù)性缺血、缺氧誘發(fā)心絞痛和心肌梗死等癥狀。臨床上通常對(duì)最佳藥物治療有抵抗的患者進(jìn)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（PCI），以解除冠心病患者冠狀動(dòng)脈狹窄、堵塞，恢復(fù)缺血區(qū)心肌組織的供血[2]。但由于缺血器官內(nèi)代謝、供需的不平衡會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的組織缺氧和微血管功能障礙，且PCI 治療后的再灌注會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答并激活細(xì)胞程序性死亡，加重組織損傷和炎癥反應(yīng)，這一現(xiàn)象稱(chēng)為缺血再灌注損傷[3，4]。丹參為唇型科植物丹參的干燥根和根莖，常用于活血化瘀，通經(jīng)止痛。丹參酮ⅡA是丹參提取物中最豐富、結(jié)構(gòu)最具有代表性的活性化合物，具有擴(kuò)血管、抗氧化、抗炎和降低血液黏滯度等作用[5～7]。丹參酮ⅡA 經(jīng)磺化后更穩(wěn)定，起效更快，更適合臨床使用。本研究通過(guò)觀察丹參酮ⅡA磺酸鈉（STS）注射液對(duì)大鼠心肌細(xì)胞氧糖剝奪/復(fù)氧（OGD/R）的作用效果，初步驗(yàn)證STS 注射液對(duì)心肌缺血再灌注損傷的預(yù)防和修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和鑒定大鼠心肌細(xì)胞H9c2 經(jīng)過(guò)復(fù)蘇后，利用抗橫紋肌肌動(dòng)蛋白抗體（anti-Sarcomeric α-actinin，ab68167，abcam）進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

1.2.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要材料 完全DMEM 培養(yǎng)基（凱基生物，KGM12800S）；DMEM w/o Glucose（Gibco，11966025）；胰蛋白酶-EDTA 消化液（Solarbio，T1300）；1×PBS（0.01M，pH7.4）（凱基生物，KGB 5001）；FBS（Gibco，10099-141）；CCK-8 法：細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（凱基生物，KGA317）；葡萄糖（阿拉丁，G107850）；STS 注射液（上海醫(yī)藥，2005310）；H9c2 細(xì)胞（武漢普諾賽，CL-0089）。

1.2.2 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)所用材料 Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit（AP101-100-kit，MULTI SCIENCES 聯(lián)科生物）；CCK8 細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（KGA317，凱基生物）；改良Masson 三色染色液（G1345，Solarbio）；中性樹(shù)脂（CW0136，CWBIO）；PCNA Polyclonal antibody（anti-PCNA,10205-2-AP，Proteintech）；Cardiac Troponin T Polyclonal antibody（anti-cTnT，15513-1-AP,Proteintech）；Goat Anti-Rabbit IgG-Cy3（As007，ABclonal)；Goat Anti-Rabbit IgG-FITC（cw0114s，CWBIO）；即用型DAPI 染液(KGA215-50，凱基生物)。

1.3 主要儀器設(shè)備

1.3.1 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，BPN-80CW）；倒置熒光顯微鏡（廣州市明美光電有限公司，MF53）；潔凈工作臺(tái)（BIOBASE，BBS-SDC）；醫(yī)用離心機(jī)（長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司，TD4A）；酶標(biāo)儀（北京六一生物科技有限公司，WD-2102B）；三氣培養(yǎng)箱（長(zhǎng)沙華曦電子科技有限公司，YCP-10S）。

1.3.2 檢測(cè)相關(guān)實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備 旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司）；低溫高速離心機(jī)（TGL-16D，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司）；NovoCyteTM流式細(xì)胞儀[NovoCyte 2060R，艾森生物（杭州）有限公司]；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9054，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；顯微鏡（BX43，OLYMPUS）。移液槍?zhuān)≧esearch plus 0.5～10μl，eppendorf）；移液槍?zhuān)≧esearch plus 20～200μl，eppendorf）；移液槍?zhuān)≧esearch plus 100～1 000μl，eppendorf）；高壓鍋(YS20ED，蘇泊爾)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 藥物配制 葡萄糖：稱(chēng)取葡萄糖粉末1.8g，加入10ml 無(wú)菌去離子水，溶解得到1M（180g/L）母液，1ml 完全培養(yǎng)基中加入25μl 葡萄糖母液，得到濃度為4.5g/L 的溶液。

STS 注射液：5mg/ml 的注射液中STS 濃度為12.6μmol/ml，向1ml 注射液中加入0.26ml 無(wú)菌去離子水得到10μmol/ml 母液，根據(jù)不同工作濃度進(jìn)行稀釋即可。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)分組 ①正常細(xì)胞組（常規(guī)培養(yǎng)不加干預(yù)）；②模型組（OGD/R 6h/18h）；③模型+低濃度STS 處理組（OGD/R+5μM STS）；④模型+中濃度STS 處理組（OGD/R+10μM STS）；⑤模型+高濃度STS 處理組（OGD/R+15μM STS）。

1.4.3 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)操作 傳代與鋪板：棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用1×PBS 洗兩遍，加入0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化，待細(xì)胞變圓后加入培養(yǎng)基終止消化并收集細(xì)胞懸液至10ml 離心管中，1 000rpm 離心3min，棄去上清液加入培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；24 孔板每孔鋪細(xì)胞3×104個(gè)，培養(yǎng)基體積為500μl；6 孔板每孔鋪細(xì)胞5×105個(gè)，培養(yǎng)基體積為1.5ml 待細(xì)胞完全貼壁后進(jìn)行藥物處理和OGD/R 造模。

細(xì)胞藥物處理與造模：將模型組、模型+STS 處理各組細(xì)胞使用PBS 洗滌2 遍，加入不完全DMEM培養(yǎng)基，模型+STS 處理組分別加入STS 5μM、10μM、15μM，放置在三氣培養(yǎng)箱中缺氧處理（缺氧條件：1%氧氣+5%CO2+94%N2），6h 后進(jìn)行復(fù)氧、復(fù)糖處理，18h 后進(jìn)行流式凋亡、免疫熒光、Masson 檢測(cè)。

1.4.4 細(xì)胞活性檢測(cè)（CCK-8 檢測(cè)） 待細(xì)胞密度約80%～90%時(shí)，將細(xì)胞進(jìn)行消化、重懸、計(jì)數(shù)、鋪板，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的STS 處理24h，將待測(cè)的96 孔板細(xì)胞換成相同的培養(yǎng)基，每孔100μl；每孔加入10μl CCK-8 試劑，置于培養(yǎng)箱中孵育2h；酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的吸光值。

1.4.5 流式檢測(cè)凋亡 按照實(shí)驗(yàn)分組處理細(xì)胞后，消化并收集細(xì)胞，加入1ml PBS 后1 500rpm 離心3min，再用PBS 洗2 遍。用雙蒸水將5×Binding Buffer 稀釋為1×Binding Buffer。取300μl 預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸細(xì)胞。每管各加入3μl Annexin V-FITC 和5μl PI-PE 或3μl Annexin V-APC 和5μl 7-ADD。輕微混勻后，室溫避光孵育10min。再向每管中加入200μl 預(yù)冷的1×Binding Buffer?；靹蚝笊狭魇郊?xì)胞儀檢測(cè)。

1.4.6 細(xì)胞Masson 染色 將細(xì)胞去上清后做常規(guī)固定，切片浸入Bouin 液，置于溫室過(guò)夜進(jìn)行媒染，蒸餾水沖洗至切片上的黃色消失。使用天青石藍(lán)染液滴染3min 后稍水洗，再用Mayer 蘇木素染色液滴染3min 后稍水洗，隨后用酸性乙醇分化液分化數(shù)秒，流水沖洗10min。加入麗春紅品紅染液滴染10min，蒸餾水稍沖洗。再用磷鉬酸溶液處理10min。棄去上清，切片不用水洗，直接滴入苯胺藍(lán)染液染5min。隨后用弱酸溶液處理2min。染完色后用95%的乙醇快速脫水。無(wú)水乙醇脫水3 次，每次10s。用二甲苯透明3 次，每次2min。最后用中性樹(shù)脂封固。

1.4.7 細(xì)胞免疫熒光雙染 細(xì)胞固定：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS 浸洗3 次，每次3min；用4%的多聚甲醛固定15min，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3min；細(xì)胞通透：0.5% Triton X-100（PBS配制）室溫通透20min。封閉：PBS 浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿上滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗孵育：移液槍吸掉封閉液，不洗，每個(gè)培養(yǎng)皿滴加足夠量的、稀釋好的一抗anti-cTnT（1∶200），4℃孵育過(guò)夜；加熒光二抗:PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Goat Anti-Rabbit IgG-Cy3（1∶100），37℃孵育30min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次3min；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量在較暗處進(jìn)行;二次封閉：PBS浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5%BSA，37℃封閉30min。一抗孵育：移液槍吸掉PBS，每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的、稀釋好的一抗anti-PCNA（1∶200），37℃孵育3h。加熒光二抗：培養(yǎng)皿復(fù)溫至室溫后，PBS 浸洗培養(yǎng)皿3 次，每次5min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Goat Anti-Rabbit-FITC（1∶100），37℃孵育45min，PBS 浸洗切片3 次，每次5min；復(fù)染核：滴加DAPI 避光孵育5min，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行染核，用PBS 浸洗多余的DAPI；封片：用20%甘油封閉培養(yǎng)皿，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。染色結(jié)果判讀：FITC 綠色熒光指示PCNA 定位，Cy3 紅色熒光為cTnT 定位，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。

1.5 數(shù)據(jù)分析所得數(shù)據(jù)用 GraphPad Prism 軟件作圖，采用SPSS 19.0 軟件包進(jìn)行處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞鑒定凍存的大鼠心肌細(xì)胞H9c2 經(jīng)過(guò)復(fù)蘇和培養(yǎng)后，利用特異性抗體anti-Sarcomeric α-actinin 進(jìn)行免疫熒光鑒定。檢測(cè)其胞內(nèi)橫紋肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)量。結(jié)果如圖1所示，在不同視野下細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)均正常，胞內(nèi)有特異性的橫紋肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)且呈現(xiàn)典型的細(xì)胞骨架樣分布。

圖1 免疫熒光檢測(cè)大鼠心肌細(xì)胞H9c2 橫紋肌肌動(dòng)蛋白的表達(dá)和分布

2.2 藥物處理細(xì)胞的適宜濃度范圍在所培養(yǎng)的細(xì)胞中加入不同濃度的STS，以摸索藥物處理細(xì)胞適合的濃度范圍。結(jié)果表明，STS 濃度≤15μM 時(shí)未出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞活力的顯著干擾，但是隨著藥物濃度的增加，在20μM 時(shí)細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。因此確定藥物的適宜處理濃度≤15μM，見(jiàn)圖2。

圖2 CCK-8 法檢測(cè)各濃度STS 處理后細(xì)胞的活力變化

2.3 不同濃度STS 對(duì)細(xì)胞OGD/R 模型的藥效在確定了STS 的適宜處理濃度后，在處理組中設(shè)置了5μM、10μM 和15μM 3 個(gè)濃度。細(xì)胞在無(wú)糖培養(yǎng)基中孵育并加入上述濃度的藥物后，置于三氣培養(yǎng)箱模擬低氧環(huán)境（1%O2+5%CO2+94%N2）培養(yǎng)6h。在1.5ml 的培養(yǎng)基體系中補(bǔ)充150μl FBS 和37.5μl 葡萄糖（1M），并置于常規(guī)CO2培養(yǎng)箱以實(shí)現(xiàn)復(fù)糖復(fù)氧培養(yǎng)，從而建立細(xì)胞糖氧剝奪后復(fù)氧復(fù)糖所造成的損傷模型。經(jīng)過(guò)18h 的常規(guī)培養(yǎng)后，利用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)細(xì)胞染色，并利用流式分析儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率。結(jié)果如圖3所示，正常組細(xì)胞的自然凋亡率為8.59%，模型組的細(xì)胞凋亡率為52.87%。表明經(jīng)過(guò)氧糖剝奪和復(fù)氧復(fù)糖之后，細(xì)胞出現(xiàn)了顯著的損傷，模型構(gòu)建成功。在3 個(gè)處理組中，不同濃度的STS 均能顯著下調(diào)細(xì)胞的凋亡率，且與藥物處理濃度呈現(xiàn)劑量依賴(lài)的趨勢(shì)，表明經(jīng)過(guò)STS 處理后能顯著預(yù)防因氧糖剝奪和復(fù)氧復(fù)糖所造成的細(xì)胞損傷，其中以15μM 的STS 濃度處理細(xì)胞后效果最好，凋亡率為12.1%。

圖3 流式儀檢測(cè)不同濃度STS 對(duì)OGD/R 模型中細(xì)胞凋亡的抑制效果

2.4 Masson 染色檢測(cè)在使用上述藥物濃度處理細(xì)胞后，利用Masson 染色來(lái)檢測(cè)經(jīng)造模和藥物干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)和纖維化的程度。染色結(jié)果如圖4所示，分別選取3 個(gè)視野觀察。結(jié)果表明正常組細(xì)胞Masson 染色后主要呈現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō)明其膠原纖維居多，模型組染色后呈紅色，為肌纖維，不同濃度STS 處理后與模型組比較其紅色減弱，表明STS 能一定程度地減輕細(xì)胞因造模導(dǎo)致的纖維化。

圖4 Masson 染色檢測(cè)心肌細(xì)胞形態(tài)和纖維化程度

2.5 免疫熒光檢測(cè)胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達(dá)量在各組細(xì)胞中均能檢測(cè)到PCNA 和cTnT 的表達(dá)。但是細(xì)胞經(jīng)過(guò)OGD/R 造模后密度顯著降低，其胞內(nèi)的PCNA 和cTnT 免疫熒光染色信號(hào)也有所減弱。經(jīng)過(guò)不同濃度的STS 處理后，細(xì)胞密度有所升高，細(xì)胞形態(tài)也有所改善（見(jiàn)圖5）。通過(guò)對(duì)免疫熒光信號(hào)強(qiáng)度分析，OGD/R 造模后細(xì)胞的PCNA 表達(dá)量有所降低，但是經(jīng)過(guò)15μM 的STS 處理后其表達(dá)量顯著上調(diào)(P=0.005)。OGD/R 造模后，細(xì)胞的cTnT 表達(dá)量降低，經(jīng)10μM 的STS 處理后，其表達(dá)量顯著上調(diào)（P=0.013）（見(jiàn)圖6）。

圖5 免疫熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達(dá)量變化

圖6 定量分析免疫熒光雙染檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PCNA 和cTnT 表達(dá)量變化

3 討論

冠心病的發(fā)作往往是由于冠狀動(dòng)脈內(nèi)斑塊的侵蝕或易損斑塊的破裂，使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心中高度促凝成分暴露于循環(huán)的血小板和凝血蛋白中，最終導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成[8]。冠心病早期治療可以降低心肌損傷的程度。因此，快速診斷和早期治療是冠心病治療的中心原則[9]。由于疾病會(huì)損害細(xì)胞膜的完整性，心肌壞死伴隨著結(jié)構(gòu)蛋白和其他細(xì)胞內(nèi)大分子向心臟間質(zhì)的釋放。心肌壞死的生物標(biāo)志物包括心肌肌鈣蛋白I 和T（cTnI和cTnT）、肌酸激酶、肌紅蛋白、乳酸脫氫酶。其中，cTnT 是檢測(cè)心肌損傷的首選生物標(biāo)志物。研究表明，cTnT 濃度升高不僅與病變的程度、心肌組織受損有關(guān)，還與血管成形術(shù)中不良預(yù)后有關(guān)[10]。臨床上cTnT 的檢測(cè)有助于早期排除心肌梗死[11]。PCNA 是存在于增殖細(xì)胞中且呈階段性表達(dá)的蛋白質(zhì)。PCNA 表達(dá)增強(qiáng)，常常代表著DNA 復(fù)制和修復(fù)[12]。本研究中對(duì)PCNA 和cTnT 的檢測(cè)能夠反映STS 對(duì)心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)和修復(fù)作用。

本研究采用了惰性氣體N2對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9c2 造模，體外模擬冠心病、心肌梗死等治療后產(chǎn)生的心肌缺血再灌注損傷，該造模方法操作簡(jiǎn)單易復(fù)制，較為環(huán)保[13]。此模型可以直接觀察STS 對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制、生長(zhǎng)形態(tài)等方面的影響，從OGD/R模型組可以看出心肌細(xì)胞H9c2 經(jīng)過(guò)OGD/R 后，細(xì)胞凋亡、損傷以及纖維化明顯，可廣泛用于該類(lèi)試驗(yàn)的造模，此與既往研究相一致[14～16]。

STS 注射液是主要成分為STS 的紅色澄明液體，STS 是丹參酮ⅡA 經(jīng)磺化后得到的衍生物，改善了丹參酮ⅡA 水溶性和生物利用度較低的缺陷[17]。研究表明，STS 能夠降低患者的QT 離散度，提高左室射血分?jǐn)?shù)，從而改善患者的心功能，降低心肌梗死再灌注治療患者室性心律失常的發(fā)生率[18]。還能通過(guò)抑制心肌細(xì)胞增生、降低膽固醇的含量、提高NO含量、抗炎等作用有效緩解心絞痛等癥狀[19]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，10μM 和15μM 濃度的STS 能顯著預(yù)防和改善由造模所引起的細(xì)胞凋亡和形態(tài)異常，顯著上調(diào)細(xì)胞內(nèi)cTnT 和PCNA 表達(dá)水平。發(fā)生心肌梗死和心絞痛的時(shí)候，由于缺血缺氧等原因，持續(xù)的細(xì)胞壞死和凋亡共同主導(dǎo)患者心肌細(xì)胞的死亡過(guò)程[20]。而STS 能夠促進(jìn)OGD/R 模擬的心臟梗死后仍有活力的心肌細(xì)胞增殖來(lái)改善心臟功能。

本研究通過(guò)驗(yàn)證STS 對(duì)OGD/R 細(xì)胞的保護(hù)作用，進(jìn)一步證明了STS 治療冠心病、心絞痛等疾病的有效性，并為臨床用藥提供數(shù)據(jù)支持。但后續(xù)仍需做深入研究，探討可能的作用機(jī)制。