鄭麗平，陸兆新，孔梁宇，胡安妥，孟凡強，別小妹

（南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，江蘇南京 210095）

鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）是引起急性胃腸炎的主要病原菌之一，是目前世界各國分離率最高的菌型之一[1]。它能引起各種家禽和哺乳動物的傳染病，也可造成人類感染，對食品安全和公共衛(wèi)生具有重要的影響[2-3]。

在食品工業(yè)中，S. typhimurium常以生物被膜的形態(tài)存在于加工器械表面。生物被膜（biofilm）是一種復雜的多糖蛋白復合物，它由附著在接觸面的細菌以及細菌分泌的胞外聚合物（EPS）組成。一旦生物被膜形成之后，菌體對宿主免疫系統(tǒng)的抵御能力增強，對常用的消毒劑、抗生素等也表現(xiàn)出更強的耐受性[4-6]。與浮游細菌相比，生物被膜菌對各種殺菌劑和環(huán)境變化的敏感性大大降低，對抑菌成分的耐受性也更強，這使清除食品加工設施上的生物被膜成為一個巨大的挑戰(zhàn)[7-8]。

S. typhimurium生物被膜的形成往往在固液相交界處，是一個動態(tài)的過程。生物被膜形成初始時，菌體在固體接觸面附著，隨著細菌生長繁殖，菌體數(shù)量逐步增大。當菌體達到一定濃度時，細菌感應到濃度信號，生長狀態(tài)開始變化，多糖、胞外蛋白等開始合成，逐漸形成成熟的生物被膜[9-10]。當菌體感應到外界環(huán)境適應時，生物被膜脫落使菌體暴露而重新游離，直至遇到新的條件而再次形成生物被膜，如此往復，對食品工業(yè)造成較大困擾[11-12]。

目前對于生物被膜的控制方法主要包括以下幾種：物理法、化學法和生物法。物理法有超聲波法、電擊法、紫外照射等；化學方法主要是指一些化學消毒劑、表面活性劑、金屬螯合物等；生物法目前研究主要集中于抗生物及其衍生物、抗菌藥物聯(lián)合使用、天然產(chǎn)物等[13-14]。其中物理法中研究較多的是超聲波處理和紫外照射，李燕杰等[15]用超聲波對單核增生李斯特菌生物被膜進行處理，得出當超聲功率為250 W、溫度35 ℃和時間7 min時，被膜清除率可達到96.34%的結論；翟立公等[16]的研究發(fā)現(xiàn)：“84”消毒液、過氧化氫、“果蔬凈”對生物被膜都有清除作用，可以使部分生物被膜脫落?！?4”消毒液對生物被膜中菌體的殺菌效果最好；過氧化氫只有高濃度時可以殺滅生物被膜中的菌；“果蔬凈”幾乎沒有殺菌作用。常冰雪[17]用乙醇、洗潔精和過氧化氫對銅綠假單胞菌生物被膜進行處理發(fā)現(xiàn)，過氧化氫具有很好的清除效果，在實驗設置最高濃度（6%）下能清除超過50%的生物被膜。“84”消毒液在有效氯含量在256 μg/mL時僅能清除20%左右的生物被膜。這說明不同種屬的菌株可能對消毒劑或是抑菌物質的耐受性是不同的。近幾年對生物被膜的控制研究多集中于天然植物提取物或是生物制劑方面。如戴雨蕓等[18]發(fā)現(xiàn)香芹酚對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制和生物被膜的清除均有較強作用效果。朱軍莉等[19]的實驗結果表明，隨著茶多酚和葡萄籽提取物作用質量濃度增加對假單胞菌生長和生物被膜的抑制作用增強，但在清除成熟生物被膜方面沒有較好的作用。王琳等[20]的研究結果顯示金銀花提取物和蒲公英提取物可以破壞假單胞菌生物被膜結構，從而清除生物被膜，并且清除效果隨質量濃度的增加而逐漸增強。

本研究分別選取了食品工業(yè)常用的幾種消毒劑、食品工業(yè)常用的食品防腐劑以及幾種天然成分。從對S. typhimurium生物被膜的形成過程及清除效果著手，評估各類清除劑在控制S. typhimurium生物被膜方面的優(yōu)劣勢，可以為食品工業(yè)中該類菌株生物被膜的控制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鼠傷寒沙門氏菌S. typhimuriumCDC3 由南京疾病預防與控制中心贈與；鼠傷寒沙門氏菌S.typhimuriumST34 南京農(nóng)業(yè)大學食品科技學院酶工程實驗室保存菌株，菌株在含有25%甘油的凍存管中于-80 ℃冰箱中冷凍保存；MTT（噻唑藍）、苯扎氯銨、苯扎溴銨、香芹酚、肉桂醛、雙乙酸鈉、乳酸鈉、苯甲酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鏈球菌素 上海麥克林試劑公司；茶多酚、百里香精油 上海源葉生物科技公司；結晶紫粉末、無水乙醇、乙二胺四乙酸（EDTA） 國藥集團；十二烷基磺酸鈉（SDS） 北京索萊寶科技有限公司；Tryptone Soy Broth（TSB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，葡萄糖2.5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，去離子水1000 mL，pH7.0～7.5，115 ℃滅菌30 min；Luria-Bertani（LB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH7.0～7.5，121 ℃滅菌20 min；0.5%結晶紫配制方法：結晶紫2.5 g，草酸銨4 g，95%乙醇100 mL，400 mL去離子水，超聲至完全溶解后備用。

MultiskanTMFC多功能酶標儀、T1300Ⅱ級生物安全柜 賽默飛世爾科技公司；SX-700高壓蒸汽滅菌鍋 日本Tomy公司；SB-5200DT超聲波清洗儀

寧波新芝生物科技股份有限公司；AY120電子天平 日本島津公司；TDL-80-2C低速臺式離心機上海安亭科學儀器廠；DRP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的活化與培養(yǎng) 取-80 ℃凍存的菌株S.typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST19接種于TSB液體培養(yǎng)基中37 ℃ 180 r/min條件下活化兩次，然后接種于TSA平板上，挑取單菌落接種于新鮮的TSB培養(yǎng)基中37 ℃ 180 r/min過夜培養(yǎng)，備用。

1.2.2 不同清除劑濃度的確定 根據(jù)中華人民共和國國家標準GB 2760-2014中明確規(guī)定的各類食品添加劑的限量標準，以此確定各類清除劑的添加比例及濃度[21]，采用的清除劑見表1。根據(jù)各類添加劑的限量標準，配制相應的母液濃度，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、SDS、EDTA、雙乙酸鈉、乳酸鈉等121 ℃，滅菌20 min；苯扎氯銨、苯扎溴銨、百里香精油、香芹酚、肉桂醛、茶多酚、洗潔精、“84”消毒液、無水乙醇、30%過氧化氫等用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。

表1 實驗中所使用的清除劑及添加量Table 1 Type and amount of scavenger used in the research

1.2.3 不同清除劑對S. typhimurium生長及生物被膜形成的影響 將已進行無菌處理的清除劑（消毒劑：洗潔精、H2O2、無水乙醇、苯扎氯銨、苯扎溴銨、EDTA和SDS；食品防腐劑：苯甲酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鈉和雙乙酸鈉；天然成分物質：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚和乳酸鏈球菌素）在原濃度的基礎上進行梯度稀釋，以SDS為例：SDS原濃度為1%，用TSB液體培養(yǎng)基將其依次稀釋至0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%。將兩株S. typhimurium以1%的接種量分別接種于上述稀釋好的溶液中，然后吸取200 μL液體接種于96孔聚乙烯板中。每個處理設置三個平行，并設置陰性對照（只添加TSB液體培養(yǎng)基）和陽性對照（添加TSB液體培養(yǎng)基并接種1%的S. typhimurium）。于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h后，觀察不同濃度的添加劑處理后生物被膜的形成情況并測定OD600nm處的吸光度值，然后采用結晶紫染色法對生物被膜進行定量測定。結晶紫染色法的操作步驟參考Pratt[22]和楊維青等[23]的方法，具體如下：棄去96孔板中多余培養(yǎng)基，用無菌水漂洗3～4次后晾干，待完全干燥后向孔中加入200 μL 0.5%的結晶紫染色液；于室溫下染色30 min，染色完畢后棄去全部染色液，用無菌水漂洗3～4次洗去浮色；待完全晾干后向每孔加入200 μL 95%的乙醇，室溫下放置15 min；用多功能酶標儀測定每孔在OD595nm處的吸光值，即為孔內生物被膜的生成量。同時每個處理設置空白對照，即只含TSB液體培養(yǎng)基不接菌液。

1.2.4 不同清除劑對S. typhimurium生物被膜的清除效果評估 將兩株S. typhimurium以1%的接種量接種于TSB液體培養(yǎng)基中，然后吸取200 μL液體接種至96孔聚乙烯板中。每個處理設置三個平行，并設置陰性對照（只添加TSB液體培養(yǎng)基）和陽性對照（添加TSB液體培養(yǎng)基并接種1%的S. typhimurium），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h。采用1.2.3中所述的結晶紫染色法測定每孔OD595nm處吸光值，即為孔內生物被膜的生成量，通過以下公式計算可得每種清除劑對生物被膜的清除率。

式中：X1為陽性對照，即不經(jīng)處理時鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的形成量；X為經(jīng)過處理后S.typhimurium生物被膜的形成量。

1.2.5 MTT法測定不同清除劑處理后S. typhimurium生物被膜態(tài)細胞的代謝活性 采用MTT法對不同清除劑處理后生物被膜內細菌的相對代謝活性進行測定，具體操作步驟參考Gerlier等[24]和楊翠云等[25]的方法并稍作改動。采用1.2.4中所述的方法培養(yǎng)并處理生物被膜，經(jīng)不同清除劑處理完畢后，無菌水清洗晾干。然后向每個孔內分別添加100 μL的TSB液體培養(yǎng)基和100 μL的MTT溶液（5 mg/mL），于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光孵育2～3 h。小心棄去孔中的MTT及培養(yǎng)基混合液，然后用無菌水清洗除盡孔中的殘液。晾干后向每個孔內添加200 μL的DMSO（二甲基亞砜）試劑，37 ℃靜置15～20 min，用酶標儀測定其在OD490nm處的吸光值，即得每個孔內細胞的相對代謝活性。

1.2.6 不同清除劑處理后S. typhimurium生物被膜菌的活菌數(shù) 菌落計數(shù)法檢測生物被膜中活菌數(shù)具體方法參考梁瑞[26]所描述的方法。生物被膜的培養(yǎng)及處理方法1.2.4中所述，經(jīng)不同清除劑處理完畢后，用無菌水洗盡殘液并晾干。之后，向每個孔內添加200 μL生理鹽水用細胞刮刀將粘附在底部和孔壁的生物被膜刮下并溶解在生理鹽水中。最后將200 μL溶有生物被膜菌的溶液轉移到1.5 mL的無菌離心管中，對其依次進行十倍梯度稀釋，然后涂布于LB固體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24 h后進行菌落計數(shù)，然后計算經(jīng)不同清除劑的不同濃度處理后兩株S. typhimurium生物被膜菌的活菌數(shù)。每組處理均設置三個平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復三次，實驗數(shù)據(jù)處理用平均值±標準偏差（Means±SD）表示，利用Graphpad Prism 9.0作圖軟件對數(shù)據(jù)進行整理和分析。

2 結果與分析

2.1 不同清除劑對S. typhimurium生物被膜形成的影響

2.1.1 食品工業(yè)常用消毒劑對S. typhimurium生物被膜形成的影響 從食品工業(yè)用消毒劑中選取了其中8種比較常見的消毒劑及抑菌成分，根據(jù)國家食品衛(wèi)生標準中推薦的每種消毒劑的使用比例及最高濃度為參考。在兩株S. typhimurium培養(yǎng)的過程中，分別將每種消毒劑以不同濃度添加到培養(yǎng)基中，測定不同消毒劑對細菌生長及生物被膜形成的影響，具體結果如圖1所示。

圖1 食品工業(yè)常用消毒劑對2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effect of commonly used disinfectants in food industry on biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

每種消毒劑分別設置了6個不同的濃度梯度，由結果可以看到消毒劑乙醇和H2O2在低濃度時即已表現(xiàn)出對兩株S. typhimurium生物被膜形成的抑制作用，甚至不產(chǎn)生物被膜（如圖1-A1B1和圖1-A4B4）。而有的消毒劑如“84”消毒液、洗潔精在高濃度下才對生物被膜的形成有一定的抑制作用，如圖1-A2B2和圖1-A3B3所示，當“84”消毒液的比例達到1:100，才對兩株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的形成起到完全抑制的作用。而當洗潔精的含量達到6%時，菌體仍然可以生長并且形成生物被膜。EDTA（圖1-A5B5）有一定的作用，但沒有表現(xiàn)出較明顯的優(yōu)勢，即使是在高濃度下也沒有完全抑制生物被膜的形成，CDC3和ST34菌株隨著表面活性劑SDS添加量的不斷增加，菌體生長逐漸受到抑制，從而生物被膜的生成能力也在下降（圖1-A6B6所示）。新型工業(yè)消毒劑苯扎氯銨和苯扎溴銨（如圖1-A7B7和圖1-A8B8），在低濃度下（0.01%）即可以有效抑制細菌的生長，使生物被膜的形成也受到抑制。

由以上結果可以得出：幾種常用消毒劑對生物被膜形成過程的抑制作用主要是通過抑制細菌菌體生長的方式實現(xiàn)的。八種消毒劑對兩種鼠傷寒沙門氏菌生物被膜形成的影響趨勢基本是一致的，乙醇、過氧化氫、苯扎氯銨和苯扎溴銨在低濃度下即可基本抑制生物被膜的形成；“84”消毒液、SDS在較高濃度下才對兩種鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的形成產(chǎn)生抑制效果；而洗潔精、EDTA即使在高濃度下抑制效果也理想。

2.1.2 食品工業(yè)常用食品防腐劑對S. typhimurium生物被膜形成的影響 食品工業(yè)用化學防腐劑已被證實在一定劑量及時間內可以防止食品的腐敗變質并且是安全的。本次研究選取了食品中常用的四種防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉和乳酸鈉，根據(jù)國家食品安全標準中對食品添加劑使用劑量的規(guī)定，針對每種防腐劑設置6個不同濃度，比較四種防腐劑對S. typhimuriumCDC3和ST34生物被膜形成的影響，結果如圖2所示。

如圖2-A1B1中所示，當苯甲酸鈉的含量達到0.4%時，對S. typhimuriumCDC3和ST34生物被膜的形成才隨著濃度的升高呈逐漸下降的趨勢，在設置的最高濃度1.0%時可以對兩株S. typhimurium生物被膜的形成起到完全抑制的作用；隨山梨酸鉀濃度的升高，生物被膜的形成能力也是逐漸降低的（圖2-A2B2）；圖2-A3B3中所示的是雙乙酸鈉對兩株S.typhimurium生物被膜形成的影響，從圖中可以看出雙乙酸鈉對生物被膜的形成過程幾乎沒有影響，隨著其濃度的增加，生物被膜形成能力變化不大；乳酸鈉（圖2-A4B4）在隨著濃度的增加時，對S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜形成量有減少的趨勢。比較這四種食品防腐劑，苯甲酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鈉可以通過抑制菌體生長的方式來抑制生物被膜的形成，并且抑制作用是隨濃度的增加而增大的，但在低濃度下抑制效果并不是很理想。雙乙酸鈉對S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34則沒有抑菌作用，生物被膜的形成能力受其影響變化也不大。

圖2 食品防腐劑對2株鼠傷寒沙門氏菌菌體生長及生物被膜形成的影響Fig.2 Effects of food preservatives on the growth and biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

2.1.3 天然成分對S. typhimurium生物被膜形成的影響 首先，確定香芹酚、肉桂醛、百里香精油和茶多酚這幾種天然成分物質的最小抑菌濃度，乳酸鏈球菌素根據(jù)國標中規(guī)定的使用劑量確定其添加量。在培養(yǎng)S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34時，分別將這幾種物質以不同濃度加入培養(yǎng)基中，測定添加前后這兩株S. typhimurium生物被膜生成量的變化。

將香芹酚、肉桂醛、百里香精油加入培養(yǎng)基后，在含量為1.0 μL/mL時，S. typhimuriumCDC3和S.typhimuriumST34的菌體即受到明顯的抑制，用結晶紫染色法測定生物被膜的形成量也很少，如圖3-A1B1、A2B2、A3B3所示；茶多酚對兩株S. typhimurium生物被膜形成的影響是隨濃度的升高變化的，隨著茶多酚含量的提高，生物被膜生成量呈下降的趨勢（圖3-A4B4）；而乳酸鏈球菌素對于兩株菌生物被膜的形成能力影響不大，即使在高濃度下（1.0 mg/mL）時也沒有其它幾種物質的抑制作用明顯，如圖3-A5B5。總的來說，在所選的三大類清除劑中，其中食品工業(yè)用消毒劑乙醇、過氧化氫、苯扎氯銨、苯扎溴銨在低濃度下即可通過抑制菌體生長而抑制生物被膜的產(chǎn)生；四種食品防腐劑，苯甲酸鈉、山梨酸鉀和乳酸鈉對生物被膜形成的影響與作用濃度有很大的關系，隨著濃度的升高，生物被膜的形成逐步減少，而雙乙酸鈉對S. typhimurium的生長幾乎沒有太大的抑制作用；在天然食品添加劑中，香芹酚、肉桂醛和百里香精油的效果也是比較好的，在培養(yǎng)基中添加量1.0 μL/mL的添加劑，即可有效抑制生物被膜的生長，當然細菌的生長也受到了極大的抑制。不同清除劑對生物被膜形成的抑制主要是通過抑制菌體的生長發(fā)揮作用的。

圖3 幾種天然食品添加劑對2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜形成的影響Fig.3 Effects of several natural food additives on biofilm formation of two strains of Salmonella typhimurium

2.2 不同清除劑對S. typhimurium生物被膜的清除效果評估

2.2.1 食品工業(yè)常用消毒劑對S. typhimurium生物被膜的清除效果 在S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34形成生物被膜后，利用上述實驗中選取的八種消毒劑在不同濃度下對成熟的生物被膜進行浸泡處理，然后測定處理前后生物被膜的變化。評估這幾種消毒劑對成熟生物被膜的清除效果，具體結果如圖4所示。

通過結晶紫染色法測定不同消毒劑浸泡處理前后S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜在OD595nm處吸光值的變化，以陽性對照為參考，可計算得出每種消毒劑在不同濃度下對生物被膜的清除率。圖4中是這八種消毒劑對S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜的清除效果。由圖中可以看出，乙醇（圖4-A1）和SDS（圖4-A5）對生物被膜的清除效果最高才達20%，而且隨著濃度的變化，生物被膜的減少量幾乎沒有太大變化。“84”消毒液在較高的比例下如1:100或1:50時，對生物被膜的清除率可以達到80%左右，但有效氯成分含量較高時會對人體具有一定的刺激性，因而不是較好的生物被膜清除劑選擇（圖4-A2）。洗潔精（圖4-A3）隨著濃度的增加，清除效果呈上升的趨勢。過氧化氫在含量為1%時對S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的清除率分別可達到50%和65%左右，當其含量達到6%時，清除率可高達90%（圖4-A4）。而EDTA、苯扎氯銨、苯扎溴銨（圖4-A6、A7、A8）的清除效果隨著濃度的增加呈逐步上升的趨勢，在高濃度下可達到60%左右。在八種消毒劑中，清除效果較好的是過氧化氫，其在低濃度下即可基本達到其它幾種清除劑的效果。

圖4 食品工業(yè)常用消毒劑對2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的清除效果Fig.4 Removal effect of common disinfectants used in food industry on 2 strains of Salmonella typhimurium biofilm

2.2.2 食品工業(yè)常用食品防腐劑對S. typhimurium生物被膜的清除效果 苯甲酸鈉和山梨酸鉀是食品工業(yè)中最常用的兩種食品防腐劑，而雙乙酸鈉和乳酸鈉則經(jīng)常被用于禽肉制品中，禽肉制品又是S.typhimurium主要的寄主之一。四種防腐劑根據(jù)國標規(guī)定的使用劑量，在生物被膜成熟之后對其進行浸泡處理，測定生物被膜的生成量。

經(jīng)四種食品防腐劑浸泡處理后，只有乳酸鈉在隨著濃度的增加時，清除生物被膜的效果逐漸上升（圖5-A4），而苯甲酸鈉、山梨酸鉀和雙乙酸鈉在濃度不斷增加時，對兩株S. typhimurium生物被膜的清除趨于平緩的增加趨勢，當其達到限量的最高劑量時，清除效果也僅僅達到了20%左右，如圖5中A1、A2、A3所示。由測定的結果可以看出，食品防腐劑對S. typhimurium生物被膜的清除作用是很小的。食品防腐劑在一定程度上可以抑制細菌的生長，但對已經(jīng)成熟的生物被膜的清除作用是很弱的。

圖5 食品防腐劑對2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的清除效果Fig.5 Removal effect of food preservatives on two strains of Salmonella typhimurium biofilm

2.2.3 幾種天然食品添加劑對S. typhimurium生物被膜的清除效果 香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚是從天然植物中提取得到的物質，乳酸鏈球菌素是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質，也被廣泛用作食品防腐劑。這些物質相比食品工業(yè)用的消毒劑和防腐劑而言具有無毒、無害、無副作用等特點。利用這幾種物質對成熟的S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的生物被膜浸泡處理，比較浸泡前后生物被膜的變化，可以評估這幾種天然成分對生物被膜的清除效果。

經(jīng)幾種天然成分處理后，分別測定每孔OD595nm處的吸光值，計算得到每種物質在不同濃度下的清除率，如圖6中所示。香芹酚、肉桂醛和百里香精油這三種物質隨著添加量的變化，清除作用也在逐步地增大，當其添加量達到10 μL/mL時，清除率可達到70%左右（圖6-A1、A2、A3）。當茶多酚的含量為0.1%時，對S. typhimuriumCDC3的清除率在40%左右，對S. typhimuriumST34的清除率達到80%左右，隨著含量的增加，清除效果還有增加的趨勢（圖6-A4）。S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34的生物被膜經(jīng)不同濃度的乳酸鏈球菌素處理過后，其減少量變化并不是很大（圖6-A5）。相比其它幾種物質來說，乳酸鏈球菌素在清除生物被膜的效果上并沒有很大的優(yōu)勢。

圖6 幾種天然食品添加劑對2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的清除效果Fig.6 Removal effect of several natural food additives on the biofilm of two strains of Salmonella typhimurium

香芹酚為單帖酚類物質，肉桂醛為醛類物質，而百里香精油中的主要成分為百里酚、沉香醇、香荊籍酚、龍腦、芫荽油醇、松油烴、丁香烴等，茶多酚是一種多酚類物質，具有較強的抗氧化性和抑菌性[18,27]。成熟生物被膜經(jīng)這四種物質處理后，可觀察到生物被膜開始變得松散，從孔板底部和側壁部分脫落并且隨著添加量的增加生物被膜變得愈松散，推測可能是香芹酚、肉桂醛和百里香精油破環(huán)了生物被膜致密的三維結構，才使得其易于從接觸材料表面脫落[28]；乳酸鏈球菌素目前報道較多的是可抑制革蘭氏陽性菌的活性，而對革蘭氏陰性菌的抑制效果不佳，因而可能無法對成熟生物被膜產(chǎn)生作用[29]。綜合比較這三大類物質對成熟生物被膜的清除效果，其中最為理想的是過氧化氫，在濃度為1%時，清即可清除50%～60%左右的生物被膜；其他的有洗潔精、EDTA、苯扎氯銨、苯扎溴銨隨著濃度的增加對生物被膜的清除效率也是上升的，在高濃度下的效果較好；食品防腐劑對于成熟生物被膜的清除作用并不理想，除乳酸鈉在最高濃度下的清除效率較高一些在60%，其他三種在設置的最大濃度下，清除率也僅有20%左右；天然食品添加劑香芹酚、肉桂醛、百里香精油對于生物被膜的清除也有一定的效果，當其添加量為10.0 μL/mL時，清除率可到70%～80%。

食品工業(yè)用消毒劑過氧化氫和“84”消毒液為強氧化劑，在加入過氧化氫后，孔內的生物被膜立即開始溶解，也即說明生物被膜中的成分與強氧化劑過氧化氫發(fā)生了反應，從而使大量的生物被膜溶解[30-31]，而“84”消毒液只有在高濃度下才有此效果；苯扎氯銨、苯扎溴銨則均為陽離子表面活性劑，可以和生物被膜中游離的部分自由基結合，從而降解部分生物被膜，洗潔精的主要成分物質也是表面活性劑，可以溶解、分散生物被膜中的部分物質，從而達到清除生物被膜的效果[32-33]。而食品防腐劑主要是通過抑制破壞或損傷微生物的細胞壁或細胞膜而抑制其生長，而成熟生物被膜具有致密的膜狀結構，導致防腐劑不能發(fā)揮更好的清除作用[34-35]。而天然成分物質多是萜類、酚類及醛類物質，這些物質可以分散或是破壞成熟生物被膜的結構，從而清除部分生物被膜，具體破壞生物被膜結構的機制還需進一步的探索[27]。

2.3 不同清除劑處理后S. typhimurium生物被膜態(tài)細胞的代謝活性和活菌數(shù)

2.3.1 食品工業(yè)常用消毒劑處理后S. typhimurium生物被膜態(tài)細胞的代謝活性和活菌數(shù) 不同清除劑處理后，通過MTT法測定每個孔在OD490nm處的吸光值，并以陰性對照和陽性對照為參考，比較消毒劑浸泡后生物被膜菌的代謝活性，并通過平板稀釋涂布法對處理后生物被膜中的活菌數(shù)進行定量，以此評估不同消毒劑對生物被膜內細胞的殺死效果，具體結果如圖7所示。

經(jīng)乙醇、過氧化氫、苯扎氯銨和苯扎溴銨四種消毒劑處理后，S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜內細胞的代謝活性隨著消毒劑濃度的增加呈降低的趨勢，其內的活菌數(shù)下降了5～6個lg值（圖7-A1B1、A4B4、A7B7和A8B8）?！?4”消毒液在稀釋比例低于1:150時，生物被膜內細胞的代謝活性才受到完全抑制，但平板涂布后發(fā)現(xiàn)被膜菌內仍有大量活菌存在（如圖7-A2B2），這說明經(jīng)高濃度的“84”消毒劑處理后，細菌可能只是暫時處于休眠狀態(tài)，一旦培養(yǎng)條件適宜即可再次恢復活性。S.typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生 物被膜菌內細胞代謝活性隨洗潔精濃度的增加有輕微的降低，沒有很明顯的趨勢，并且平板計數(shù)后可以看到有大量的活細胞存在，這可能是由于生物被膜致密的結構增加了菌體對洗滌劑的耐受能力；EDTA和SDS可以降低S. typhimuriumCDC3生物被膜內細胞的代謝活性，但并沒有完全殺死細菌，當培養(yǎng)條件合適時，大量細菌恢復活力又得以繼續(xù)生長，對S.typhimuriumST34來說，這兩種物質對生物被膜菌代謝活性雖有影響但沒有完全抑制，并且和CDC3一樣，只是使生物被膜內的細菌暫時處于“亞致死”狀態(tài)。

圖7 消毒劑處理后2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜態(tài)細胞的代謝活性和活菌數(shù)Fig.7 Metabolic activity and viable bacteria count of two strains of Salmonella typhimurium biofilm cells treated with disinfectant

2.3.2 食品工業(yè)常用食品防腐劑處理后S. typhimurium生物被膜細胞的代謝活性 4種食品防腐劑處理后，S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜菌代謝活性及活菌數(shù)的變化結果如圖8所示。隨著苯甲酸鈉、山梨酸鉀、乳酸鈉濃度的增加，其生物被膜內細胞的代謝活性呈現(xiàn)降低的趨勢，但是到達設置的最高濃度時也沒有完全使生物被膜內細胞失活如圖8-A1B1、A2B2、A4B4中的柱狀圖所示；對被膜內的活菌數(shù)和定量計算發(fā)現(xiàn)，隨濃度的增加活菌數(shù)下降的并不是很多，苯甲酸鈉和山梨酸鉀作用后，只下降了1～2個lg值（圖8-A1B1、A2B2中折線圖），乳酸鈉作用后，下降了3～4個lg值（圖8-A4B4中折線圖）；而雙乙酸鈉處理后，不管是生物被膜內的細胞的代謝活性還是活細胞數(shù)變化都不是很大（圖8-A3B3），這說明雙乙酸鈉對鼠傷寒沙門氏菌的抑制或殺滅作用很弱。

圖8 食品防腐劑處理后2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜細胞的代謝活性和活菌數(shù)Fig.8 Metabolism activity and viable count of the biofilm cells of two Salmonella typhimurium strains treated with food preservatives

2.3.3 幾種天然食品添加劑處理后S. typhimurium生物被膜細胞的代謝活性和活菌數(shù) 菌株CDC3和ST34生物被膜細胞經(jīng)香芹酚、肉桂醛、百里香精油處理后，代謝活性明顯降低，并且隨著添加量的增加，生物被膜細胞的代謝活性不斷降低直至完全受到抑制，其內的活菌數(shù)隨著添加劑濃度的升高不斷降低，由起初的lg8下降到lg3左右（如圖9-A1B1、A2B2、A3B3）；茶多酚對生物被膜細胞代謝活性的影響趨勢和上述三種物質是一致的，但抑制效率稍弱一些，其內的活菌數(shù)有小幅度的下降（圖9-A4B4）；而乳酸鏈球菌素對于生物被膜內細胞的代謝活性影響不是很明顯，平板計數(shù)結果也顯示，乳酸鏈球菌素處理后，生物被膜內仍然有大量活菌存在（圖9-A5B5）。

圖9 天然食品添加劑處理后2株鼠傷寒沙門氏菌生物被膜細胞的代謝活性和活菌數(shù)Fig.9 Metabolism activity and viable bacteria count of two strains of Salmonella typhimurium biofilm cells treated with natural food additives

在所有選擇的三大類清除劑中，乙醇、過氧化氫、苯扎氯銨和苯扎溴銨這四種食品工業(yè)用消毒劑可以較好地抑制生物被膜內細胞的代謝活性，且可以大大降低被膜內的活菌數(shù)；4種食品防腐劑處理后對于生物被膜內細胞代謝活性和活菌數(shù)有一定的影響，但效果不是很明顯；另外，香芹酚、肉桂醛和百里香精油在殺滅生物被膜內活細胞方面也有很好的效果，乳酸鏈球菌素幾乎不抑制沙門氏菌的生長。

3 結論與討論

本研究分別選取了食品工業(yè)上常用的幾種化學消毒劑：乙醇、“84”消毒液、洗潔精、H2O2、苯扎氯銨和苯扎溴銨，另外還有金屬螯合劑EDTA和表面活性劑SDS；食品加工中常用的四種防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀、雙乙酸鈉及乳酸鈉；最后又選擇了幾種天然成分物質：香芹酚、肉桂醛、百里香精油、茶多酚以及抗菌物質乳酸鏈球菌素。以S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34為研究對象，分別從對生物被膜形成過程的影響、對成熟生物被膜的清除效果、以及不同物質處理后生物被膜菌內細胞的代謝活性及活菌存活數(shù)這四個方面，評估了這些物質在鼠傷寒沙門氏菌生物被膜控制方面的作用效果?？梢缘贸鲆韵聨讉€結論：

首先，化學消毒劑乙醇、H2O2、苯扎氯銨、苯扎溴銨在較低濃度下即可有效地抑制S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜的形成，并且對成熟的生物被膜浸泡處理后，可以大大降低其內細胞的代謝活性及活菌數(shù)，不過在清除成熟生物被膜方面，較為理想的是過氧化氫，當其濃度達到6%時，對生物被膜的清除率可達到90%左右。

本研究中，苯甲酸鈉、山梨酸鉀和乳酸鈉在高濃度下對兩株S. typhimurium的生物被膜形成有較明顯的抑制作用，但低濃度下效果不好，而雙乙酸鈉則幾乎沒什么作用。謝麗斯等[36]用山梨酸鉀和苯甲酸鈉對金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程的影響進行研究，得出了在添加低質量濃度防腐劑山梨酸鉀和苯甲酸鈉后，金黃色葡萄球菌成膜能力也受到抑制的結論，這和本研究所得出的結論稍有不同。在對成熟生物被膜清除的實驗中發(fā)現(xiàn)，防腐劑清除效果很弱，較高濃度下才發(fā)揮一定的清除作用。四種食品防腐劑處理S. typhimuriumCDC3和S. typhimuriumST34生物被膜后，對其內的細胞代謝活性進行檢測發(fā)現(xiàn)隨著防腐劑濃度的增加，被膜內細胞的活性降低，再通過平板稀釋涂布法定量檢測活菌數(shù)時，發(fā)現(xiàn)活菌數(shù)的下降程度也不明顯，即防腐劑處理后，細胞活性的降低只是使沙門氏菌進入了休眠狀態(tài)，并沒有完全殺滅細菌，一旦條件合適，細菌即可繼續(xù)生存。

在幾種天然食品添加劑中，比較理想的是肉桂醛、香芹酚和百里香精油，這三種物質在低濃度下可基本抑制生物被膜的產(chǎn)生。這與戴雨蕓等[18]所研究的香芹酚對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制，張文艷等[37]研究的肉桂醛對食源性致病菌金黃色葡萄球菌和腸炎沙門氏菌生物被膜的形成有抑制作用的結果是一致的，Niu等[38]也發(fā)現(xiàn)肉桂醛可以通過殺死細菌來有效抑制E.coli生物被膜的形成，在本研究中也發(fā)現(xiàn)，添加劑可以通過抑制菌體的生長而抑制生物被膜的產(chǎn)生。當這三種天然食品添加劑作用于成熟生物被膜后也可有效殺死生物被膜內的活菌數(shù)。

目前關于天然成分物質對生物被膜形成的抑制機理主要涉及抑制細菌菌體的生長、抑制群體感應系統(tǒng)，以及抑制生物被膜中胞外多糖和胞外蛋白的合成等方面。植物精油的成分復雜，一種精油通常由幾十種到幾百種化合物組成，主要為萜烯類化合物、芳香族化合物、脂肪族化合物、含硫含氮化合物等小分子簡單化合物[39]。已有很多研究證明天然植物精油中的主要成分是比較理想的群體感應抑制劑，群體感應抑制劑只是輕微抑制或不抑制細菌的生長，不會細菌的生長造成壓力[27,40]。有研究表明芳樟醇不僅能抑制細菌的群體感應系統(tǒng)，還具有殺菌作用，芳樟醇可以破環(huán)銅綠假單胞菌的生物被膜，導致核酸外泄，殺滅細菌[41]。另有研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的大蒜活性化合物在不影響銅綠假單胞菌生長的情況下，抑制該菌QS系統(tǒng)調控的毒力因子的產(chǎn)生，并且抑制生物被膜的形成以及群集運動[27,42]。此外，天然植物成分還可通過抑制或降解生物被膜基質的主要成分來抑制生物被膜的形成。如程鋒等[43]發(fā)現(xiàn)茶樹精油可通過抑制agrA、icaA、cidA及sarA等4種基因的表達，抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成過程中eDNA的釋放以及PIA的合成，降低了生物被膜的粘附性，從而表現(xiàn)出抗生物被膜活性。而在本研究中發(fā)現(xiàn)香芹酚、肉桂醛和百里香精油可抑制細菌菌體的生長使菌體產(chǎn)生物被膜能力下降。如Khan等[44]也發(fā)現(xiàn)牛至中的香芹酚可通過降低變形鏈球菌的代謝活性，抑制生物被膜的形成。對于香芹酚、肉桂醛和百里香精油對本研究中鼠傷寒沙門氏菌生物被膜形成產(chǎn)生抑制的具體影響機制還需進一步的研究探索。

根據(jù)以上的結果可以總結出，不管是何種物質在清除成熟生物被膜時都沒有達到100%的效果，這就可能會使得殘留的生物被膜中微生物繼續(xù)生長，導致加工環(huán)境或者產(chǎn)品受到再次污染。經(jīng)不同材料處理后雖然有些物質表現(xiàn)出了較好的殺生物被膜菌的效果，但還是會有少部分細菌被生物被膜包裹起來而增強了對外界環(huán)境的耐受力，這也會是一個安全隱患[45]?？刂粕锉荒の廴镜淖钸m宜的方法是在初始培養(yǎng)前，加入抑菌物質，抑制細菌菌體的生長，從而有效地控制生物被膜的形成。

本研究共選取了17種清除劑，分別是食品工業(yè)常用的8種消毒劑、常用的4種食品防腐劑以及5種天然食品添加劑，分別從四個方面系統(tǒng)比較了它們對生物被膜的控制及清除效果，發(fā)現(xiàn)過氧化氫不僅可以有效抑制S. typhimurium生物被膜的形成，對成熟生物被膜的清除也具有較好的效果，這對于食品工業(yè)中控制鼠傷寒沙門氏菌生物被膜的污染具有一定的參考意義。此外，在生物被膜形成的初始階段控制生物被膜的污染是最為有效的。

目前，國內對于生物被膜的控制研究多是集中在革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌等和革蘭氏陰性菌如副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌等，針對沙門氏菌，尤其是S. typhimurium生物被膜的控制及清除研究報道的還較少。即使有報道，也只是單一的選取一種清除劑，并沒有系統(tǒng)地比較多種清除劑或是不同控制方法的清除效果。本研究選取的清除劑涉及種類多、涵蓋范圍廣，可以為尋找有效控制生物被膜污染提供一個思路。