劉寧，劉毅，秦亞莉，韓誠，閆川慧，賀文彬

1.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西 太原 030024；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）和帕金森?。≒arkinson disease，PD）是神經(jīng)退行性疾病的典型代表。目前認(rèn)為，AD的病理特征是光鏡下腦神經(jīng)細(xì)胞外出現(xiàn)β淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）沉積形成的老年斑（senile plaques，SP）和細(xì)胞內(nèi)Tau蛋白異常磷酸化，以及由此引發(fā)的神經(jīng)元纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）和大腦新皮層及海馬突觸丟失、神經(jīng)炎癥、神經(jīng)細(xì)胞的死亡[1]；PD的發(fā)病機(jī)制傾向于黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元的變性壞死，并且出現(xiàn)含有嗜酸性的路易小體[2]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，二者基本病機(jī)均為“腎虛髓空”，并據(jù)此指導(dǎo)臨床治療。本課題組前期研究顯示，地黃飲子干預(yù)AD和PD的方證效應(yīng)機(jī)制可能與泛素蛋白酶體系統(tǒng)衰退有關(guān)[3]。

地黃飲子出自《圣濟(jì)總錄》，由熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志共12味藥組成，有滋腎陰、補腎陽、化痰開竅之功。方中熟地黃、山茱萸滋陰填精益髓、滋補腎陰，肉蓯蓉、巴戟天溫腎壯陽，溫而不燥，四藥相配，陰陽并補，培補下元虛衰，共為君藥；附子、肉桂大辛大熱，益火助陽，協(xié)助肉蓯蓉、巴戟天補腎壯陽以溫下元，攝納浮陽并引火歸元，石斛、麥冬、五味子滋養(yǎng)肺腎，為臣藥；石菖蒲與遠(yuǎn)志、茯苓合用，化痰開竅，為佐藥；另以姜、棗和中為使。全方陰陽雙補，上下同治，以培補下元虛衰之本為主，兼化痰開竅，可謂標(biāo)本兼顧。中藥方劑具有多成分、多靶點、多通路發(fā)揮作用的特點，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對地黃飲子“異病同治”AD、PD的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行闡釋，為中醫(yī)“異病同治”理論提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物有效成分篩選及靶點匹配

通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索熟地黃、巴戟天、山茱萸、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、石菖蒲的化學(xué)成分。通過中國知識資源總庫（CNKI，https://www.cnki.net/），主題檢索2015年1月1日－2020年12月1日文獻(xiàn)中遠(yuǎn)志、石斛、麥冬的化學(xué)成分。通過SwissADME平臺（http://www.swissadme.ch/）篩選地黃飲子組方藥物有效成分，篩選條件：胃腸道吸收（GI absorption）為高（High）、血腦屏障滲透（BBB permeant）為是（Yes）、類藥性（Drug likeness）大于2個符合（Yes）。篩選出的有效成分結(jié)合TCMSP和SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）得到相關(guān)靶點，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）匹配靶點基因名。

1.2 疾病靶點獲取

通過GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/#）、TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫分別檢索“Alzheimer Disease”“Parkinson’s Disease”，得到AD、PD相關(guān)疾病靶點，并將3個數(shù)據(jù)庫所得靶點分別合并、去重，再利用UniProt數(shù)據(jù)庫匹配已驗證的人類靶點基因名。

1.3 藥物-疾病交集靶點獲取

利用微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn/）將地黃飲子藥物靶點分別與AD、PD相關(guān)疾病靶點取交集，獲得地黃飲子有效成分直接與疾病相關(guān)的靶點。

1.4 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以疾病、地黃飲子、組方藥物、藥物有效成分及其相關(guān)靶點為節(jié)點，以各節(jié)點間相互關(guān)系為邊，利用Cytoscape3.8.0構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的Degree值篩選關(guān)鍵成分。利用STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）構(gòu)建藥物-疾病交集靶點蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治鲆院Y選關(guān)鍵靶點。

1.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析

將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入Cytoscape3.8.0的BiNGO、ClueGO插件，分別進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析，并進(jìn)行可視化。

1.6 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點分子對接

選取疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵成分及藥物-疾病交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵靶點，分別在Zinc（https://zinc.docking.org/）、PDB（http://www.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫中獲取3D結(jié)構(gòu)，并使用Vina進(jìn)行分子對接，將其中對接最好的組合使用Pymol進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 藥物有效成分和對應(yīng)靶點

通過TCMSP、CNKI檢索及篩選，獲得地黃飲子有效成分127種（重復(fù)成分10種），其中熟地黃、巴戟天、山茱萸、石斛、肉蓯蓉、附子、五味子、肉桂、茯苓、麥冬、石菖蒲、遠(yuǎn)志分別為2、12、14、19、5、7、8、0、6、15、2、37種。結(jié)合SwissTargetPrediction，得到藥物靶點926個。

2.2 疾病靶點

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫得到AD相關(guān)靶點9 554個、PD相關(guān)靶點7 657個，以相關(guān)度大于中位數(shù)進(jìn)行篩選，分別獲得AD、PD靶點4 780、4 362個；此外，OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫分別得到AD靶點305、29個，PD靶點367、23個。將以上所得靶點分別合并、去重，通過UniProt數(shù)據(jù)庫匹配已驗證過的人類靶點，共獲得AD疾病靶點4 523個，PD疾病靶點3 733個。

2.3 藥物-疾病交集靶點

將藥物靶點與疾病靶點取交集，獲得地黃飲子分別與AD、PD直接相關(guān)的交集靶點653、466個。

2.4 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和交集靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape3.8.0構(gòu)建疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果見圖1。網(wǎng)絡(luò)中Degree＞100的12個關(guān)鍵成分分別為槲皮素、l4-(4-羥基苯乙基)-2,6-二甲氧基苯、l3-O-甲基槲皮素、2-羥基-4,6-二甲氧基二苯甲酮、1,7-二甲氧基-2,3-亞甲基二氧雜蒽酮、4-(3,5-二甲氧基苯乙基)苯酚、對羥基苯乙基阿魏酸酯、N-對香豆酰酪胺、5-羥基-3,7-二甲氧基-1,4-菲醌、1,2,3,6,7-五甲氧基呫噸酮、激肽原A、甲基對苯二酚B。將藥物與AD、PD的交集靶點分別導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，通過CytoNCA插件分析網(wǎng)絡(luò)并限定DC、BC、CC、NC、LAC值均大于等于4倍中位數(shù)，得到PPI核心網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點即關(guān)鍵靶點，見圖2。

圖1 地黃飲子治療AD、PD疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

圖2 地黃飲子治療AD、PD交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO和KEGG富集分析結(jié)果

將藥物-疾病交集靶點導(dǎo)入BiNGO，設(shè)定置信水平為0.01，進(jìn)行GO富集分析，結(jié)果見圖3。GO生物過程（biological process）主要包括生物反應(yīng)、對刺激的應(yīng)答、細(xì)胞過程、信號過程、代謝過程等，GO分子功能（molecular function）包括結(jié)合、催化活動、分子轉(zhuǎn)運活動、電荷轉(zhuǎn)運活動等，GO細(xì)胞組分（cellular component）以細(xì)胞成分、突觸成分、細(xì)胞外域等為主。將交集靶點導(dǎo)入ClueGO，設(shè)定P value≤0.005、最小聚類為30、K-score為0.55，進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果見圖4。AD主要通路有TNF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)信號通路、雌激素信號通路、NF-κB信號通路、HIF-1信號通路等，PD主要通路有TNF信號通路、神經(jīng)營養(yǎng)信號通路、甲狀腺激素信號通路、胰島素抵抗、流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化。

圖3 地黃飲子治療AD、PD交集靶點GO富集分析結(jié)果關(guān)聯(lián)圖

圖4 地黃飲子治療AD、PD交集靶點KEGG通路富集分析結(jié)果

2.6 分子對接結(jié)果

關(guān)鍵靶點和關(guān)鍵成分分子對接結(jié)合能大多低于-5.0 kcal/mol，提示關(guān)鍵成分均可與關(guān)鍵靶點形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，見表1。將對接結(jié)果最好的關(guān)鍵成分激肽原A與關(guān)鍵靶點PTGS2可視化，二者可通過疏水口袋形成對接，見圖5。

表1 地黃飲子治療AD、PD關(guān)鍵靶點與關(guān)鍵成分分子對接結(jié)合能（kcal/mol）

圖5 激肽原A與PTGS2分子對接構(gòu)象圖

3 討論

“異病同治”是中醫(yī)辨證論治特有的治療法則，由于證候具有時相性和空間性的特征，一種證候可能存在于多種疾病中，故可以采用相同的方法進(jìn)行治療。AD屬中醫(yī)學(xué)“呆病”“癡呆”范疇，PD屬中醫(yī)學(xué)“顫證”范疇，二者基本病機(jī)均為“腎虛髓空”[4]，其發(fā)病機(jī)制均與神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用、miRNA表達(dá)、自噬過程的調(diào)節(jié)作用及P62蛋白的降解作用有密切關(guān)系[5]。因此，AD與PD的中醫(yī)證候和西醫(yī)病理機(jī)制均有共同點，采用相同方藥進(jìn)行治療有其理論依據(jù)，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接對其進(jìn)行分析和驗證。

地黃飲子治療AD的臨床和基礎(chǔ)研究報道多以已知信號通路為切入點[6-8]。張麗等[9]采用地黃飲子治療AD患者60例，認(rèn)為其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)Notch1、ASAM10及BACE1蛋白，降低丙烯醛濃度有關(guān)。臨床使用地黃飲子治療PD有顯著療效[10]?，F(xiàn)有研究基本圍繞氧化應(yīng)激展開，而針對異常蛋白狙擊和神經(jīng)炎癥等研究很少，考慮地黃飲子可能通過抗氧化應(yīng)激、抑制細(xì)胞凋亡、減輕神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)、抑制蛋白異常聚集、誘導(dǎo)自噬、改善線粒體能量代謝等方面發(fā)揮治療PD的作用[11]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析地黃飲子組方藥物有效成分及其作用靶點，得到該方治療AD和PD的相關(guān)信號通路為TNF信號通路和神經(jīng)營養(yǎng)信號通路。研究顯示，神經(jīng)營養(yǎng)因子（NTs）是一類調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育、分化及功能的因子，它可激活2種不同類型的受體，包括酪氨酸激酶的Trk家族和腫瘤壞死因子受體超家族中的p75NTR，進(jìn)而啟動復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[12]。在神經(jīng)退行性病變中，NTs在神經(jīng)系統(tǒng)不同部位的表達(dá)水平與生理狀態(tài)下有顯著差異，提示NTs的表達(dá)與神經(jīng)退行性變密切相關(guān)，如在AD中基底核的前腦基底膽堿能神經(jīng)元神經(jīng)生長因子（NGF）表達(dá)下降[13-14]，而在AD受累最嚴(yán)重的海馬區(qū)域額葉皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)元NGF表達(dá)上升[15-16]，表現(xiàn)出與病理狀態(tài)相反的改變。與之不同的是，腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）在海馬區(qū)、額葉皮質(zhì)區(qū)和膽堿能神經(jīng)元聚集區(qū)表達(dá)水平較高，并起到支持相應(yīng)腦區(qū)神經(jīng)元存活、促進(jìn)神經(jīng)生長及維持突觸可塑性的作用[17-18]。項捷[19]研究發(fā)現(xiàn)，BDNF減少后，TrkB與Tau相互作用是導(dǎo)致AD發(fā)病的重要原因。

NTs作為一個龐大家族，其中的保守性多巴胺神經(jīng)營養(yǎng)因子家族在PD多巴胺神經(jīng)元的修復(fù)中起到至關(guān)重要的作用。林瑤等[20]研究顯示，經(jīng)補腎復(fù)方干預(yù)后，PD模型大鼠額葉、紋狀體的大腦多巴胺能神經(jīng)營養(yǎng)因子（CDNF）、中腦膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（MANF）蛋白及mRNA表達(dá)水平升高，提示補腎復(fù)方可能通過增加不同腦區(qū)CDNF和MANF的表達(dá)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，從而防治PD。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)闡釋地黃飲子“異病同治”AD和PD的分子生物學(xué)機(jī)制，可為中醫(yī)“異病同治”理論提供依據(jù)，并為AD和PD的精準(zhǔn)治療提供研究思路。