曾 謙，黃星雨，何嘉敏，華亞蒙，張新玲，朱增芳，毛曉英，吳慶智，張 建

（石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832000）

鷹嘴豆（Cicer arietinumL），屬野豌豆族[1]。近年來(lái)，我國(guó)鷹嘴豆產(chǎn)量成倍增長(zhǎng)，具有“鷹嘴豆之鄉(xiāng)”之稱的新疆木壘縣目前已經(jīng)形成了6.67 khm2的鷹嘴豆種植面積，占我國(guó)鷹嘴豆種植面積的83%[2]。植物蛋白作為人類食物蛋白重要來(lái)源之一，其已經(jīng)成為解決世界人口日益增加問(wèn)題的一種全新的食物蛋白來(lái)源[3]。試驗(yàn)選用的鷹嘴豆蛋白質(zhì)含量為24.2%，對(duì)研究蛋白質(zhì)氧化具有重要意義。通常，蛋白質(zhì)氧化是指活性氧自由基直接作用于蛋白質(zhì)分子，或蛋白質(zhì)分子與氧化副產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變[4]。一般認(rèn)為，活性氧自由基與蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈和肽鏈骨架反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子發(fā)生裂解或者交聯(lián)[5]。蛋白質(zhì)中的半胱氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等氨基酸殘基易與活性氧自由基反應(yīng)[6-7]。試驗(yàn)采用的是羥自由基氧化體系對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)進(jìn)行氧化，而羥自由基氧化體系主要由抗壞血酸、過(guò)氧化氫（H2O2）、三氯化鐵（FeCl3）三者在一定條件下進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生。目前，有些學(xué)者已經(jīng)通過(guò)羥自由基體系的研究證實(shí)，蛋白質(zhì)可以被活性氧自由基氧化，這種氧化會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)造成不可逆的變化，如蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂、蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)聚合而生成變性高聚物、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中氨基酸發(fā)生氧化脫氧及改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失生物活性[8]。李學(xué)鵬等人[9]研究了模擬氧化體系對(duì)六線魚(yú)蛋白質(zhì)的影響，認(rèn)為羥自由基會(huì)對(duì)其魚(yú)肉蛋白質(zhì)的羰基、總巰基、游離氨基酸含量產(chǎn)生影響。Wu W等人[10]用不同濃度AAPH自由基對(duì)大豆分離蛋白氧化24 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于未氧化的大豆分離蛋白來(lái)說(shuō)，氧化后的樣品中的α-螺旋結(jié)構(gòu)和β-折疊結(jié)構(gòu)明顯降低。

因此，試驗(yàn)以鷹嘴豆蛋白為主要研究對(duì)象，采用羥自由基氧化體系氧化鷹嘴豆蛋白，研究鷹嘴豆蛋白的羰基含量、二聚酪氨酸含量、表面疏水性、內(nèi)源熒光、溶解性的變化，討論羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及溶解度的影響，為鷹嘴豆蛋白產(chǎn)品在加工及貯藏過(guò)程中品質(zhì)控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

精選鷹嘴豆，木壘縣鷹哥生物科技有限公司提供；三氯乙酸（TCA），天津永晟精細(xì)化工有限公司提供；乙二胺四乙酸（EDTA），上海金錦樂(lè)實(shí)業(yè)有限公司提供；十二烷基硫酸鈉（SDS），天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；其他試劑，均為分析純。

SP-752/752PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；F-7000型熒光光譜儀，日本日立公司產(chǎn)品；PHS-3C型雷磁pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司產(chǎn)品；LGJ-18S型冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)，費(fèi)默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 鷹嘴豆分離蛋白的制備

根據(jù)毛曉英等人[11]的方法。鷹嘴豆室溫下干燥后粉碎成鷹嘴豆粉。鷹嘴豆粉過(guò)60目篩，正己烷脫脂，豆粉∶正己烷為1∶5（W∶V），室溫下連續(xù)攪拌60 min，豆粉自然沉降與上層正己烷分離，倒出正己烷進(jìn)行回收，豆粉再重復(fù)上述操作2次。最后將鷹嘴豆粉置于通風(fēng)櫥中室溫干燥12 h，將處理好的脫脂豆粉裝袋置4℃冰箱中保存。脫脂鷹嘴豆粉與水1∶10（W∶V）混合，用1 mo/L NaOH調(diào)pH值至8.3，攪拌提取1 h，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，沉淀再按料液比為1∶5（W∶V）提取2次，將3次上清液混合，上清液用1 mol/L HCl調(diào)pH值至等電點(diǎn)（pH值4.5）沉淀蛋白，攪拌使沉淀復(fù)溶后，溶液置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，得到的沉淀加適量蒸餾水后用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，凍干。

1.2.2 氧化鷹嘴豆蛋白的制備

參考Park D等人[12]的方法構(gòu)建以下氧化體系：使FeCl3濃度0.1 mmol/L，抗壞血酸濃度0.1 mmol/L恒定，共設(shè)置5個(gè)H2O2濃度，濃度分別為0，0.5，1.0，5.0，10.0 mmol/L，構(gòu)建氧化體系。將鷹嘴豆蛋白均勻分散于構(gòu)建的氧化體系中，于4℃條件下氧化24 h，然后用1 mmol/L乙二胺四乙酸終止反應(yīng)，并將終止后的鷹嘴豆蛋白漿置于離心機(jī)中以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，得到的沉淀加適量蒸餾水后用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，凍干。上述氧化反應(yīng)在15 mmol/L哌嗪-N，N'-雙（2-乙磺酸）緩沖溶液（pH值6.0，離子強(qiáng)度0.6 mmol/L）中進(jìn)行。

1.2.3 羰基含量的測(cè)定

用去離子水配置蛋白質(zhì)溶液5 mg/mL，再用雙縮脲法測(cè)上清液蛋白質(zhì)含量。用2,4-二硝基苯肼法[13]測(cè)定蛋白質(zhì)中羰基含量。取1 mL已知濃度的樣品蛋白，放入離心管，每管中加入10 mmol/L DNPH(2,4-二硝基苯肼1 mL，溶劑為2 mol/L HCl）；室溫避光反應(yīng)1 h，每15 min使用渦旋振蕩器攪拌1次；加1 mL 20%TCA（三氯乙酸）終止反應(yīng)，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，棄上清液；用1 mL乙酸乙酯∶乙醇（1∶1）清洗沉淀3次；加6 mol/L鹽酸胍溶液3 mL，于37℃水浴保溫15 min溶解沉淀，以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心10 min，保留上清液；紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)370 nm處測(cè)定吸光度，使用分子吸光系數(shù)22 000 M/cm計(jì)算其含量。

計(jì)算公式：

式中：C——羰基含量，nmol/mg；

A——吸光度；

ε——22 000 M/cm；

b——比色光徑（1 cm）。

1.2.4 二聚酪氨酸含量測(cè)定

鷹嘴豆蛋白溶液2 mg/mL，用雙縮脲法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量。參考Davies KJ A等人[14]的方法采用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，參數(shù)設(shè)定為發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)420 nm，激發(fā)波長(zhǎng)325 nm，靈敏度4，狹縫寬度均為10 nm，二聚酪氨酸的含量用相對(duì)熒光值（單位A.U.）來(lái)表示，相對(duì)熒光值的計(jì)算公式如下：

相對(duì)熒光值（單位A.U.）=

1.2.5 表面疏水性的測(cè)定

參照Huang Y R等人[15]的方法采用ANS做熒光探針，測(cè)定鷹嘴豆蛋白的表面疏水性。用0.01 mol/L pH值7.0磷酸鹽緩沖液溶解0.5 g鷹嘴豆蛋白樣品，磁力攪拌2 h后用考馬斯亮藍(lán)指劑法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)濃度，用磷酸鹽緩沖液稀釋，使其最終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL。用pH值7.0的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）將蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度稀釋到0.005~0.500 mg/mL，取4 mL稀釋蛋白樣品并加入50μL ANS溶液（8 mmol/L，采用0.01 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液配制）；同時(shí)，測(cè)定不加ANS溶液的稀釋蛋白作為空白。采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定樣品的熒光強(qiáng)度（在激發(fā)波長(zhǎng)365 nm，發(fā)射波長(zhǎng)484 nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，狹縫設(shè)置為5，靈敏度設(shè)置為2），在上述條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)濃度作圖，蛋白質(zhì)分子的表面疏水性指數(shù)（H0）是曲線初始階段的斜率[16]。

1.2.6 內(nèi)源熒光的測(cè)定

參照王丹丹等人[17]的方法測(cè)定鷹嘴豆蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度。利用熒光計(jì)獲得蛋白質(zhì)樣品的固有發(fā)射熒光光譜，鷹嘴豆蛋白樣品溶解于0.01 mol/L pH值7.0的磷酸鹽緩沖液，使溶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。以溶解樣品的磷酸鹽緩沖液為空白。激發(fā)波長(zhǎng)283 nm，掃描波段為300~400 nm，靈敏度為1，中速。

1.2.7 溶解度的測(cè)定

蛋白質(zhì)溶解性的測(cè)定根據(jù)葉林[18]的方法，略作修改。將鷹嘴豆蛋白樣品溶于去離子水中，磁力攪拌1 h，離心后取上清液，測(cè)定波長(zhǎng)540 nm處吸光度。以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。溶解度為樣品蛋白質(zhì)含量和溶液蛋白質(zhì)含量的比值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示，樣本重復(fù)數(shù)n=3。采用SPSS statisics 23.0的Dukeny檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性分析，采用Origin8.5軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白羰基含量的影響

蛋白質(zhì)氧化后會(huì)有許多變化，其中羰基的形成是最明顯的變化之一[7]。因此，可將蛋白質(zhì)中羰基的形成作為蛋白被氧化的測(cè)定指標(biāo)之一，羰基主要由氨基酸側(cè)鏈（一般是對(duì)活性氧自由基敏感的帶有NH或NH2的氨基酸殘基）及肽鍵的氧化斷裂產(chǎn)生[9]。所以，蛋白質(zhì)中羰基形成越多表明蛋白質(zhì)被羥自由基氧化的程度越高。

羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白羰基含量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白羰基含量的影響

試驗(yàn)設(shè)置一組空白對(duì)照（H2O2濃度為0）。由圖1可知，隨著H2O2濃度的增加，羰基的形成逐漸增加。與空白組蛋白羰基含量相比，隨著H2O2濃度增加，羰基含量顯著增加。羰基可能是由于羥自由基與氨基酸側(cè)鏈或肽鏈發(fā)生氧化反應(yīng)產(chǎn)生，且羥自由基濃度與蛋白質(zhì)中羰基含量呈正相關(guān)[19-20]。雷葉斯等人[21]在研究羥自由基氧化體系對(duì)大黃魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響中也有類似的結(jié)果：0~10 mmol/L H2O2處理時(shí)，大黃魚(yú)肌原纖維蛋白氧化程度增加即蛋白羰基含量呈上升趨勢(shì)。章銀良等人[22]關(guān)于羥自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化損傷的研究得出結(jié)論，隨著雙氧水濃度的增加和氧化時(shí)間的延長(zhǎng)，羰基含量整體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。

2.2 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白二聚酪氨酸含量的影響

蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基被羥自由基氧化，通過(guò)化學(xué)鍵的作用形成蛋白質(zhì)聚合物，稱為二聚酪氨酸，因此蛋白質(zhì)中二聚酪氨酸的含量可作為蛋白質(zhì)氧化的重要指標(biāo)之一[5，23]。

羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白二聚酪氨酸含量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白二聚酪氨酸含量的影響

由圖2可知，隨著H2O2濃度的增加，二聚酪氨酸的含量呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，這說(shuō)明酪氨酸殘基對(duì)羥自由基敏感。方海硯等人[24]在研究羥自由基氧化對(duì)鰱魚(yú)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)的影響時(shí)得到了類似結(jié)論，0~10 mmol/L H2O2處理時(shí)，隨著H2O2濃度的增加，二聚酪氨酸含量也顯著增加。陳霞霞等人[25]在研究自由基模擬氧化銀鯧肌原纖維蛋白也得到了類似結(jié)果。

2.3 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白表面疏水性的影響

一般采用ANS熒光探針?lè)y(cè)量H0的變化，用于檢測(cè)蛋白質(zhì)表面的疏水位點(diǎn)的變化，表征蛋白質(zhì)的變性程度[26]。在評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)物理化學(xué)性質(zhì)及結(jié)構(gòu)變化的過(guò)程中，蛋白質(zhì)表面疏水性有重要作用，其可以表達(dá)蛋白質(zhì)分子間的相互作用能力[27]，在一定程度上能反映蛋白質(zhì)的氧化程度，且與蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)聯(lián)系緊密[28]。

羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白表面疏水性的影響見(jiàn)圖3。

圖3 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白表面疏水性的影響

由圖3可知，鷹嘴豆蛋白的表面疏水指數(shù)隨著羥自由基濃度的增加而顯著下降，從0.202 7降低至0.106 2（p<0.05）。其中，吳偉等人[29]研究結(jié)果表明被氧化后的大豆蛋白空間結(jié)構(gòu)易發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白表面疏水性下降。蛋白質(zhì)被羥自由基氧化發(fā)生變性，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)遭到破壞，使內(nèi)部部分氨基酸殘基（指脂肪族與芳香族等氨基酸殘基）被氧化，使位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性基團(tuán)暴露，在疏水作用下，這些暴露的基團(tuán)相互作用，使得氧化蛋白聚合形成蛋白聚集體，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的表面疏水性降低[30]；此外，由于氧化使蛋白結(jié)構(gòu)打開(kāi)又重新組合，使疏水基團(tuán)嵌入，新的親水基團(tuán)形成（如羰基），導(dǎo)致疏水基團(tuán)下降[31]。實(shí)際的表面疏水性主要是由蛋白質(zhì)中分散的或聚集的顆粒決定的[32]，蛋白質(zhì)共價(jià)聚集，導(dǎo)致部分疏水基團(tuán)掩埋，從而使蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)數(shù)量減少，由此說(shuō)明其結(jié)構(gòu)得到改變[17]。

2.4 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白內(nèi)源熒光的影響

在一定激發(fā)波長(zhǎng)照射下，含有色氨酸（Trp）殘基、酪氨酸（Tyr）殘基和苯丙氨酸（Phe）殘基等芳香族氨基酸殘基的蛋白質(zhì)會(huì)產(chǎn)生熒光，稱為內(nèi)源熒光[33]。例如，確定蛋白質(zhì)內(nèi)色氨酸殘基的相對(duì)位置及表示蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變均可以通過(guò)色氨酸最大內(nèi)源熒光發(fā)射波譜實(shí)現(xiàn)[34]。同時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)色氨酸殘基被氧化程度及其微環(huán)境的變化也可通過(guò)色氨酸最大內(nèi)源熒光發(fā)射波譜表示，進(jìn)而能夠表征羥自由基氧化蛋白質(zhì)后對(duì)其三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響[17]。

羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白內(nèi)源熒光的影響見(jiàn)圖4。

圖4 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白內(nèi)源熒光的影響

由圖4可知，天然鷹嘴豆蛋白最大熒光峰位在320 nm處。當(dāng)過(guò)氧化氫氧化體系濃度從0增加到10 mmol/L時(shí)，鷹嘴豆蛋白λmax強(qiáng)度從141.24降低到70.37，最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移。其熒光藍(lán)移，說(shuō)明隨著氧化程度的增加，色氨酸被轉(zhuǎn)移到更加疏水的非極性環(huán)境中。Ye L等人[35]研究花生蛋白氧化對(duì)結(jié)構(gòu)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著活性氧自由基濃度的增加，花生蛋白熒光強(qiáng)度逐漸下降且最大熒光峰位藍(lán)移，造成熒光強(qiáng)度下降的原因是氧化蛋白形成蛋白聚集體，使色氨酸進(jìn)入內(nèi)部的非極性環(huán)境。Wu W等人[36]研究氧化大豆蛋白時(shí)，結(jié)果表示氧化大豆蛋白最大內(nèi)源熒光藍(lán)移，表明大豆蛋白質(zhì)內(nèi)被確定位置的色氨酸殘基經(jīng)氧化后而被掩蔽，使得蛋白質(zhì)聚集。由上述結(jié)果表明，內(nèi)源熒光強(qiáng)度下降，是羥自由基氧化體系濃度的增加使得色氨酸使色氨酸的微環(huán)境變?yōu)橛H水。進(jìn)而可以得出結(jié)論，氧化可以使鷹嘴豆蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化。

2.5 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白溶解度的影響

影響蛋白質(zhì)溶解度的因素主要分為內(nèi)因和外因，如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-水之間相互作用均會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解。

羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白溶解度的影響見(jiàn)圖5。

圖5 羥自由基氧化對(duì)鷹嘴豆蛋白溶解度的影響

由圖5可知，隨著H2O2濃度的增加，溶解度逐漸降低，且蛋白溶解度由4.08%降低至0.87%。鷹嘴豆蛋白樣品溶解度下降是因?yàn)榈蜐舛鹊牧u自由基氧化使得鷹嘴豆蛋白形成了可溶性聚集體，而高濃度的羥自由基氧化導(dǎo)致的共價(jià)交聯(lián)使得產(chǎn)生的可溶性聚集體進(jìn)一步發(fā)生聚集形成不可溶性聚集體[37]。吳偉等人[38]在研究過(guò)氧自由基氧化大米蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，大米蛋白共價(jià)交聯(lián)形成不可溶性聚集體，使得大米蛋白溶解性降低，蛋白質(zhì)與脂質(zhì)氫過(guò)氧化物相結(jié)合之后，使得蛋白質(zhì)的能態(tài)發(fā)生變化，引起蛋白質(zhì)變性是導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低的內(nèi)在原因。而在鄧克權(quán)[39]的研究中也可得出氧化使得大豆球蛋白乳化性、乳化穩(wěn)定性、起泡性、泡沫穩(wěn)定性、凝膠硬度及凝膠強(qiáng)度下降。由試驗(yàn)結(jié)果可以得出，氧化對(duì)蛋白溶解度影響比較大。

3 結(jié)論

通過(guò)研究可以看出，鷹嘴豆蛋白經(jīng)過(guò)羥自由基氧化后，其結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，并隨著濃度的改變發(fā)生不同程度的改變。隨著H2O2濃度的增加，蛋白質(zhì)羰基含量、二聚酪氨酸含量呈現(xiàn)顯著增加趨勢(shì)(p<0.05)；表面疏水性從0.202 7降低到0.106 2（p<0.05）；內(nèi)源熒光強(qiáng)度顯著下降且最大熒光峰位發(fā)生藍(lán)移；蛋白質(zhì)溶解度顯著降低。因此，在鷹嘴豆蛋白加工和貯藏過(guò)程中應(yīng)采取措施防止鷹嘴豆蛋白發(fā)生氧化，并對(duì)活性氧自由基誘導(dǎo)蛋白質(zhì)氧化對(duì)其結(jié)構(gòu)及溶解度提供相關(guān)理論依據(jù)。