徐唐蕓，黃達(dá)敏，魯東昊，陸 翔，陳凌濤，陳培云

（浙江萬(wàn)里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315000）

隨著人工合成添加劑安全問(wèn)題的日益凸顯及人們對(duì)健康的關(guān)注，以植物為原料獲取安全、無(wú)毒、高效的生物活性物質(zhì)已成為當(dāng)前亟待解決的重要問(wèn)題[1]。低共熔溶劑（Deep Eutectic Solvents，DESs），主要是由氯化膽堿（Choline chloride，ChCl）等氫鍵受體與糖（葡萄糖、蔗糖、果糖等）、有機(jī)酸（乳酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸等）、多元醇（乙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇）等氫鍵供體組成的液體混合物。作為一種環(huán)境友好型溶劑，低共熔溶劑具有蒸汽壓低、制備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、可生物降解、無(wú)毒、對(duì)不同極性化合物提取能力強(qiáng)、提取效率高、可回收重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)[2-5]，可用于替代傳統(tǒng)或有毒的有機(jī)試劑。目前，DESs已被成功應(yīng)用于植物活性成分的萃取，包括萃取黃芩、丹參、金銀花、木豆葉、降香葉、紅花、槐花、青蒿、夏枯草、茴香等中藥材，橄欖油、棕櫚油等食用油，山竹果、蔓越橘、葡萄、李子等水果，西蘭花、洋蔥等蔬菜，沙棘葉等植物葉子中的黃酮類(lèi)化合物、酚酸、花青素、萜類(lèi)化合物、皂苷類(lèi)和生物堿等，對(duì)天然活性成分表現(xiàn)出高效的提取效果[6-13]。

花青素因其抗氧化、抗癌、保護(hù)視網(wǎng)膜、降低血脂、抗衰老和改善腸道健康等作用而備受人們的關(guān)注[14]。提取花青素常規(guī)提取溶劑多選擇甲醇、乙醇、丙酮、水或者混合溶劑等，大多具有毒性，普遍存在污染環(huán)境的問(wèn)題。在應(yīng)用DESs提取植物花青素方面，欒琳琳等人[15]建立了以含水量為40%的氯化膽堿/1,2-丙二醇低共熔溶劑，從桑葚果渣中提取花青素的方法。Sang J等人[16]利用含10%水（V/V）的氯化膽堿/1,2-丙二醇（1∶2，mol/mol）的低共溶熔劑從黑枸杞中提取和分離總花色苷。紫薯色素屬于花青素類(lèi)物質(zhì)，含量豐富且穩(wěn)定性高，紫薯產(chǎn)量高，價(jià)格低廉，提取成本低，以紫薯為原料可以有效地解決當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)花青素的不足。設(shè)計(jì)合成低共熔溶劑用于紫薯的提取研究，以紫薯中花青素的提取率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化紫薯中花青素的提取工藝，以期提供一種高效環(huán)保的提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯，購(gòu)于寧波當(dāng)?shù)爻?；氯化膽堿、葡萄糖、尿素、蔗糖、醋酸鈉、冰醋酸，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

L18-Y91A型高速破壁調(diào)理機(jī)，九陽(yáng)股份有限公司產(chǎn)品；HH-2型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海蟻霖科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；QL861型漩渦振蕩器，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；LC-180型低速離心機(jī)，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品；UV-3000PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海翱藝儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同低共熔溶劑的制備

參照文獻(xiàn)[17]方法制備低共熔溶劑。將氫鍵供體（HBD）氯化膽堿和不同的氫鍵受體（HBA）（葡萄糖、檸檬酸、蔗糖、尿素等）放入60℃真空干燥箱中干燥24 h，在圓底燒瓶中將一定的摩爾比HBD和HBA充分混合。在加熱條件下，用磁力攪拌器攪拌，得到澄清、均勻、透明的混合物。冷卻至室溫后，在真空干燥箱中于80℃下干燥48 h后，將其取出并密封儲(chǔ)存。

1.3.2 紫薯樣品處理

選擇新鮮的紫薯，清洗后90℃下烘干5 h至恒質(zhì)量，研缽粉碎、過(guò)90目篩，得到紫薯粉，避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 紫薯花青素的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取1.000 g處理好紫薯樣品，置于試管中。以低共熔溶劑為提取溶劑，加入10 mL于試管中進(jìn)行水浴提取，提取結(jié)束后，離心后取上清液進(jìn)行花青素的測(cè)定。

1.3.4 花青素提取率的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[18]方法。取上清液1 mL于10 mL比色管中，加入9 mL pH值4.5緩沖液，靜置2 h，紫薯花色苷的最大吸收波長(zhǎng)為530 nm。在波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水作對(duì)照溶劑調(diào)零。重復(fù)測(cè)定3次，記錄數(shù)據(jù)。

計(jì)算值即得100 g原料中含總花色苷含量（mg）。式中：E——530 nm處用分光光度計(jì)直接測(cè)定的吸

光度（A530）；

V——萃取液測(cè)定時(shí)稀釋的總體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，g；

98.2 ——1%花色苷摩爾消光系數(shù)。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

（1）不同低共熔溶劑對(duì)紫薯花青素得率的影響。固定含水量20%，摩爾比1∶2，料液比1∶10，浸提時(shí)間2 h，浸提溫度60℃，選擇了4種氫鍵供體（檸檬酸、葡萄糖、尿素、蔗糖）和氫鍵受體（氯化膽堿）按2∶1的摩爾比進(jìn)行組合配制形成天然低共熔溶劑，考查4種不同氫鍵供體低共熔溶劑對(duì)紫薯花青素提取的影響。

（2）摩爾比對(duì)紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿-檸檬酸為提取紫薯花青素的DES溶劑，在含水量為20%，料液比為1∶10，溫度為60℃，提取時(shí)間為2 h，考查氯化膽堿與檸檬酸摩爾比分別為1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5，1∶3.0，1∶3.5，1∶4.0時(shí)制備的DESs對(duì)提取紫薯中花青素的影響。

（3）含水量對(duì)紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，料液比為1∶10，溫度為60℃，浸提時(shí)間為2 h，考查含水量為15%，20%，25%，30%，35%的DESs分別進(jìn)行提取，確定提取效果最佳時(shí)的DESs含水量。

（4）不同提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，在料液比為1∶10，含水量為20%，溫度為60℃，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 h，計(jì)算紫薯花青素得率，確定提取效果最佳的時(shí)間。

（5）不同提取溫度對(duì)紫薯花青素得率的影響。固定氯化膽堿與檸檬酸摩爾比為1∶2，在料液比為1∶10，含水量為20%，提取時(shí)間為2 h，提取溫度分別為20，30，40，50，60，70，80℃時(shí)，計(jì)算紫薯花青素得率?？疾?0~80℃溫度變化范圍內(nèi)，不同溫度變化因素對(duì)紫薯花青素提取的影響。

1.3.6 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果，選取提取工藝條件摩爾比、含水量、溫度和提取時(shí)間進(jìn)行L9（34），探討該4個(gè)因素及其不同水平對(duì)紫薯中花青素提取的影響。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 DES種類(lèi)對(duì)紫薯花青素得率的影響

提取溶劑對(duì)提取效果起關(guān)鍵作用，不同氫鍵供體的類(lèi)型是影響DESs密度、表面張力和黏度等物理化學(xué)性質(zhì)的因素，也對(duì)目標(biāo)成分的提取有重要影響[19]。以氯化膽堿為HBA，并選擇不一樣的HBD，加熱攪拌后制備DES。比較不同的HBD的DES對(duì)花青素得率的影響，制備4種不同的DES，花青素得率的大小依次為檸檬酸>葡萄糖>蔗糖>尿素。因此，最終確定氯化膽堿-檸檬酸為最佳提取溶劑，作為后續(xù)的試驗(yàn)條件。

不同低共熔溶劑對(duì)紫薯花青素的提取率見(jiàn)圖1。

圖1 不同低共熔溶劑對(duì)紫薯花青素的提取率

2.1.2 低共熔溶劑體系的摩爾比對(duì)紫薯花青素得率的影響

摩爾比對(duì)紫薯花青素提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 摩爾比對(duì)紫薯花青素提取率的影響

由圖2可知，隨HBA-HBD摩爾比的增大，得率也在提高，在HBA-HBD摩爾比為1∶2時(shí)達(dá)到最大值，在更高的摩爾比時(shí)，得率反而下降?？赡苁且?yàn)槟柋葹?∶2的DES具有更低的黏度和表面張力，提高了傳質(zhì)率，使提取溶劑更易去滲透和促進(jìn)溶出紫薯中的花青素。因此，確定氯化膽堿（HBA）/1,4-丁二醇（HBD）摩爾比為1∶3的DES為最佳比例的提取溶劑，作為后續(xù)的試驗(yàn)條件。

2.1.3 提取含水量的影響

含水量對(duì)紫薯花青素提取的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，隨著DES含水量的增多，花青素的得率不斷上升，當(dāng)DES含水量為20%時(shí)，花青素提取率為0.937 mg/g，達(dá)到最高；含水量超過(guò)25%后，花青素得率開(kāi)始下降。這可能是因?yàn)楹坑绊慏ES的極性和黏度，水的加入使DES的黏度降低和極性增加，但是過(guò)量的水反而會(huì)抑制成分間的相互作用，因此確定DES最佳含水量為20%作為后續(xù)的試驗(yàn)條件。

圖3 含水量對(duì)紫薯花青素提取的影響

2.1.4 提取時(shí)間的影響

提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 提取時(shí)間對(duì)紫薯花青素提取率的影響

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，紫薯花青素的得率升高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到2.5 h后，紫薯花青素得率達(dá)到最大，且不再增加反而出現(xiàn)降低。這可能是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的增加，使DES充分滲透于紫薯顆粒中，促使目標(biāo)物質(zhì)溶出，使花青素得率提高。而進(jìn)一步延長(zhǎng)萃取時(shí)間可能會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)化合物的分解或者是發(fā)生其他的化學(xué)反應(yīng)。因此，確定2.5 h為最佳提取時(shí)間。

2.1.5 提取溫度的影響

提取溫度對(duì)紫薯花青素提取的影響見(jiàn)圖5。

圖5 提取溫度對(duì)紫薯花青素提取的影響

由圖5可知，隨著提取溫度在一定范圍內(nèi)的不斷升高，紫薯花青素得率呈上升趨勢(shì)。當(dāng)提取溫度到達(dá)60℃時(shí)，得率到達(dá)最高，隨后得率隨提取溫度的升高反而降落。這可能是因?yàn)樯邷囟葧?huì)導(dǎo)致DES的黏度、表面張力和極性降低，有利于花青素的溶出，升高溫度會(huì)加快分子的活動(dòng)，加快目標(biāo)物質(zhì)擴(kuò)散。但過(guò)高的溫度將會(huì)導(dǎo)致花青素發(fā)生如水解、氧化等反應(yīng)，從而降低得率。因此，確定提取溫度為60℃。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見(jiàn)表5。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表5可知，提取過(guò)程中含水量和提取溫度這2個(gè)因素對(duì)紫甘薯中花青素的提取效果影響較大，低共熔溶劑的摩爾比和提取時(shí)間這2個(gè)因素的影響效果較小，因素影響順序?yàn)锽>C>D>A。即含水量>提取溫度>提取時(shí)間>摩爾比，提取過(guò)程中含水量和提取溫度對(duì)紫薯中花青素提取效果影響較大，低共熔溶劑的摩爾比和提取時(shí)間的影響較小。最佳提取組合為A2B3C3D3，即含水量25%，摩爾比1∶2.0的氯化膽堿-檸檬酸體系為提取劑，料液比為1∶10，提取溫度80℃，提取時(shí)間3.0 h為紫薯花青素最佳提取條件，此時(shí)花青素的提取率達(dá)1.086±0.022 mg/g。

3 結(jié)論

紫薯中富含花青素，采用低共熔溶劑作為溶劑，以紫薯花青素得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)優(yōu)化紫薯花青素的提取工藝。選用摩爾比為1∶2.0的氯化膽堿-檸檬酸制備低共熔溶劑，取得當(dāng)?shù)凸踩廴軇┖繛?5%，料液比1∶10，提取溫度80℃，提取時(shí)間3.0 h時(shí)，花青素得率可達(dá)1.086±0.022 mg/g的結(jié)果。該方法工藝條件溫和，不需要高溫高壓，花青素的提取率較高，水解和生物分解損失率低。該研究結(jié)果表明低共熔溶劑可作為提取紫薯中花青素的有效提取溶劑。