白 天，岳 爽，趙路陽，衛(wèi) 敏*

1.河南省食品檢驗研究院，河南 鄭州 450003

2.國家市場監(jiān)管重點實驗室(食品安全快速檢測與智慧監(jiān)管技術(shù))，河南 鄭州 450003

3.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001

赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)是一種由青霉菌和曲霉菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，具有很強的腎毒性、肝毒性、免疫毒性和致畸致癌作用等，污染范圍廣泛[1]。因此，建立一種靈敏、有效的分析方法對OTA進行檢測，對于維護食品安全及保護人類健康尤為重要。電化學(xué)核酸適配體傳感器是一種將電化學(xué)檢測方法與核酸適配體結(jié)合起來的新型傳感器，由于具有特異性好、操作簡單、易于實現(xiàn)現(xiàn)場檢測等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注。目前利用電化學(xué)核酸適配體制備傳感器，對提高檢測靈敏度至關(guān)重要。

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來越多的金納米材料，如金納米顆粒和金納米棒等[2-4]，由于其比表面積大、導(dǎo)電性好和生物相容性好等優(yōu)點，被廣泛用作載體來固定多個標記物以實現(xiàn)信號放大，從而提高傳感器的檢測靈敏度。作為一種新型材料，金納米星(GNSs)由于具有尖銳尖端的多分支結(jié)構(gòu)，更適合于富集和檢測生物分子[5]。Li等[6]研究表明，由于GNSs的特殊結(jié)構(gòu)和形貌，其電催化效果優(yōu)于商用金電極、金納米顆粒和金納米棒。由于碳材料具有比表面積大和良好導(dǎo)電性的優(yōu)點，如石墨烯、多孔碳等，被廣泛用作載體以增強電化學(xué)性能[7-10]。其中，生物質(zhì)多孔碳材料因具有低成本、易獲得、可重復(fù)生產(chǎn)、對環(huán)境友好，以及儲量豐富等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注[11-13]。目前已有研究表明，在多孔碳材料中摻雜氮元素，能有效改善多孔碳分散性差的問題，提高材料的導(dǎo)電性和生物相容性[14]。但是，氮源一般是以有機試劑作為原料，成本較高，難以實現(xiàn)商業(yè)化。因此，選擇成本低的小麥原料作為碳源和氮源來制備生物質(zhì)氮摻雜多孔碳(NDPC)。

目前，關(guān)于使用GNSs或NDPC進行OTA電化學(xué)檢測的報道幾乎沒有。因此，作者利用GNSs和NDPC作為雙重信號放大策略，用于提高檢測的靈敏度。制備的GNSs作為修飾材料，可以固載更多的OTA核酸適配體(Apt)和加速電極表面的電子轉(zhuǎn)移，制備NDPC固載互補鏈(cDNA)和硫堇(Th)，構(gòu)建Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE檢測OTA，為食品安全檢測提供了技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

OTA的核酸適配體(Apt)(5′-GAT CGG GTG TGG GTG GCG TAA AGG GAG CAG CAT CGG ACA-HS-3′)、互補鏈(cDNA)(5′-CCA CAC CCG ATC-bio-3′)：上海生工生物股份有限公司。赭曲霉毒素A：Sigma-Aldrich公司。玉米樣品購買于當(dāng)?shù)爻?，將其研磨成粉后備用?/p>

所有電化學(xué)試驗均在CHI660E電化學(xué)工作站上進行。三電極系統(tǒng)：以金電極(AuE)為工作電極，飽和氯化銀電極為參比電極，鉑絲電極為對電極。JSM-7610F掃描電子顯微鏡(SEM)、JEM-2100透射電子顯微鏡(TEM)：日本JEOL。

1.2 試驗方法

1.2.1 金納米星(GNSs)的制備

采用檸檬酸鈉一步還原法制備金種子溶液，再由生長溶液生長法生成GNSs[15]。

1.2.2 生物質(zhì)氮摻雜多孔碳材料(NDPC)的制備

模板SiO2球的制備參考文獻[8-9]。分別取0.7 g SiO2球、0.7 g小麥粉至三口瓶中，然后加入30 mL去離子水，超聲混合30 min，在室溫下攪拌8 h，接著在80 ℃中干燥24 h。之后在管式爐里面進行煅燒處理，在N2氛圍下，以4 min/℃的升溫速率加熱到800 ℃，保持2 h，然后冷卻至室溫。用10%氫氯酸溶液除去SiO2模板，再用去離子水洗滌，60 ℃干燥12 h，即得到NDPC。

1.2.3 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器的制備

在干凈的AuE電極表面進行氨基化處理，得到NH2-AuE。將10 μmol/L Apt與GNSs混合孵育3 h，然后滴加5 μL于電極表面，37 ℃下孵育2 h，得到Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器。

將10 mg/mL NDPC、50 μg/mL鏈霉親和素(SA)、10 μmol/L生物素修飾的互補DNA(bio-cDNA)溶液混合在一起，37 ℃孵育2 h。然后加入10 mg/mL Th溶液孵育20 min。將Apt-GNSs/NH2-AuE電極浸泡其中，37 ℃下孵育90 min，得到Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器。

1.2.4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器對OTA的檢測

利用差分脈沖伏安法(DPV)測定Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器孵育OTA前后的峰電流。當(dāng)OTA不存在時，大量Th-NDPC-cDNA通過與Apt雜交，固定在電極表面，Th產(chǎn)生一個高的初始峰電流。加入OTA后，由于OTA與Apt之間的親和力高于Apt與cDNA之間的親和力，因此Th-NDPC-cDNA從電極表面解離，電極表面的Th量減少，峰值電流降低。根據(jù)加入OTA前后電流信號的變化，可以實現(xiàn)對OTA的檢測。

1.2.5 實際樣品檢測

取1 g研磨的玉米粉加入不同濃度的OTA，然后與5 mL萃取溶劑(甲醇與水體積比為6∶ 4 )混合，置于振蕩器振蕩30 min后再將萃取體系以8 000 r/min離心10 min，用0.45 μm濾膜過濾上清液后，使用50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)將濾液稀釋100倍。根據(jù)上述預(yù)處理方法，分別制備0.01、0.10 、1.00 ng/mL的OTA加標玉米粉樣品提取液。用Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器對加標玉米樣品進行檢測，并進行回收率分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗原理

如圖1所示，巰基修飾的Apt通過Au—S鍵固定在GNSs修飾的AuE表面，并滴加BSA封閉電極表面非特異性位點。NDPC與SA混合形成NDPC-SA，bio-cDNA通過SA-bio特異性結(jié)合，形成NDPC-cDNA。利用NDPC的多孔結(jié)構(gòu)吸附Th，得到Th-NDPC-cDNA。Apt和cDNA雜交，可得到Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE。當(dāng)OTA不存在時，Th-NDPC-cDNA被固定在電極表面，得到較大的電流a；當(dāng)OTA存在時，OTA與Apt特異性結(jié)合形成OTA-Apt復(fù)合物，Apt的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致Th-NDPC-cDNA脫落，電極表面固載的Th分子減少，此時得到較小的電流b。

圖1 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE的制備及其對OTA的檢測原理

2.2 GNSs和NDPC的形貌表征

由圖2a和圖2b可知，制備的GNSs的顆粒直徑為70～100 nm，分布均勻且具有明顯的三維分支結(jié)構(gòu)。由圖2c可知，SiO2球的粒徑約為200 nm，具有良好的單分散性。由圖2d可知，除去SiO2之后的NDPC表面由多孔蜂窩結(jié)構(gòu)的空心半球組成，平均直徑為200 nm。

注：a.GNSs的掃描電鏡圖； b.GNSs的透射電鏡圖； c.SiO2的掃描電鏡圖； d.NDPC的透射電鏡圖。

2.3 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器的電化學(xué)表征

不同修飾電極在5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-(含KCl 0.1 mol/L)溶液中的電化學(xué)阻抗(EIS)見圖3。由圖3可知，裸電極AuE(a)的阻抗(Rct)為63.97 Ω。將氨基固定在AuE表面以獲得NH2-AuE(b)后，Rct增加到92.32 Ω。將Apt-GNSs組裝在NH2-AuE(c)上時，由于帶負電的GNSs和Apt的磷酸骨架阻止了[Fe(CN)6]3-/4-到達電極表面，因此Rct增加到145.3 Ω。為了封閉電極上的非特異位點，將BSA滴加在Apt-GNSs/NH2-AuE上，Rct進一步增加到705.1 Ω(d)。當(dāng)Th-NDPC-cDNA固定在Apt-GNSs/NH2-AuE上后，Rct明顯降至210.9 Ω(e)，這是由于帶正電的Th和具有良好導(dǎo)電性的NDPC協(xié)同促進了電極表面的電子轉(zhuǎn)移。在OTA存在的情況下，由于OTA與Apt之間的親和力較高，Th-NDPC-cDNA從AuE表面釋放，從而使Rct增加至311.4 Ω(f)。

注：a.AuE； b.NH2-AuE； c.Apt-GNSs/NH2-AuE；d.BSA/Apt-GNSs/NH2-AuE； e.Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE； f.OTA/Th -NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE。

2.4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器對OTA的檢測

從圖4可知，當(dāng)OTA不存在時，大量Th-NDPC-cDNA通過與Apt雜交，固定在電極表面，峰電流為23.57 μA。加入0.5 ng/mL OTA后，由于OTA與Apt之間的親和力高于Apt與cDNA之間的，Th-NDPC-cDNA從電極表面解離，峰電流降低至6.25 μA，減小了17.32 μA。根據(jù)加入OTA前后電流信號的變化，可以實現(xiàn)對OTA的檢測。

圖4 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE在50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.4)中的差分脈沖

2.5 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器的優(yōu)化

研究不同濃度Apt對Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器性能的影響，結(jié)果如圖5a所示。當(dāng)OTA質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時，Apt濃度在0.5～1.5 μmol/L范圍內(nèi)，ΔI呈上升趨勢，這是由于隨著Apt濃度的增加，Apt的固載量也在增加，ΔI持續(xù)增大。當(dāng)Apt濃度超過1.5 μmol/L時，ΔI減小，這是由于過量的Apt會阻礙電極表面的電子轉(zhuǎn)移。故而Apt的最佳濃度為1.5 μmol/L。

由于NDPC的濃度會影響cDNA和信號探針Th的固載量，從而影響所制備傳感器Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE的檢測信號，因此對NDPC的濃度進行優(yōu)化。如圖5b所示，當(dāng)OTA質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時，隨著NDPC質(zhì)量濃度增大至4 mg/mL，cDNA和Th的固載量增加，ΔI持續(xù)增大。當(dāng)NDPC質(zhì)量濃度繼續(xù)增大時，ΔI呈下降趨勢，這是由于多余的NDPC可能會堆疊在傳感器表面，影響了OTA與Apt的結(jié)合。因此，選擇NDPC的最佳質(zhì)量濃度為4 mg/mL。

圖5 不同濃度Apt和NDPC對Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器的影響

2.6 標準曲線的建立

圖6為OTA質(zhì)量濃度在0～5 ng/mL范圍內(nèi)對應(yīng)的微分脈沖伏安法(DPV)曲線，隨著OTA質(zhì)量濃度的增加，峰值電流不斷減小。從圖7可知，OTA質(zhì)量濃度在0.001～5.000 ng/mL范圍內(nèi)，ΔI與lgCOTA之間呈線性關(guān)系，線性方程為ΔI=2.86lgCOTA+18.24 (R2=0.992)。該傳感器的檢出限為0.22 pg/mL (S/N=3)，與其他文獻的檢出限比較如表1所示。由表1可以看出，制備的傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出限，這是因為電極表面修飾的GNSs比表面積大、生物相容性好、導(dǎo)電能力強，可以加速電極表面的電子轉(zhuǎn)移，實現(xiàn)信號放大。而具有大比表面積、良好生物相容性的NDPC，可以提高cDNA和Th的固載量，起到二次信號放大的作用。

圖6 Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE傳感器對OTA在0～5 ng/mL范圍內(nèi)的DPV曲線

圖7 ΔI與lgCOTA的線性關(guān)系

表1 不同方法檢測OTA的結(jié)果比較

2.7 實際樣品檢測

利用制備的傳感器對玉米樣品進行加標檢測，結(jié)果如表2所示。玉米樣品的平均回收率為89%～104%，說明該傳感器可檢測實際樣品中的OTA。

表2 玉米樣品中OTA的檢測 (n=3)

3 結(jié)論

利用GNSs比表面積大、導(dǎo)電能力強的優(yōu)點，將其作為電極修飾材料，達到加速電極表面的電子轉(zhuǎn)移的目的，實現(xiàn)信號放大。利用NDPC比表面積大和生物相容性良好的特點，將其作為載體固定cDNA和電化學(xué)信號探針Th，起到二次信號放大的作用。制備的新型Th-NDPC-cDNA/Apt-GNSs/NH2-AuE，實現(xiàn)了OTA的高靈敏檢測。本研究可用于基于核酸適配體的其他目標物的檢測，為食品安全檢測提供了技術(shù)支撐。