趙菲，佟長青，李偉，曲敏

(大連海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連 116023)

羊棲菜Sargassumfusiforme屬于褐藻門馬尾藻屬的一種海洋孢子植物，以浙江、福建和遼寧沿海地區(qū)居多[1]。中國藥典早有記載，羊棲菜營養(yǎng)豐富，含有多種生物活性物質(zhì)，如維生素、多酚類物質(zhì)、多糖和蛋白質(zhì)等[2]，近年的研究表明，羊棲菜具有降血脂、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力和延緩衰老的作用[3]，因此，羊棲菜在醫(yī)藥、食品和化妝品等領(lǐng)域具有重要應(yīng)用價值[4]。

酵素是一種發(fā)酵產(chǎn)物，能夠參與機(jī)體新陳代謝等生命活動[5]。酵素食品是指以各種蔬菜、水果等為原料，采用各種有益菌發(fā)酵劑進(jìn)行發(fā)酵制成的產(chǎn)品，含有多種營養(yǎng)成分和各種微生物及其代謝產(chǎn)物，具有改善腸道功能、增強(qiáng)免疫力等特性。酵素發(fā)酵原料多種多樣，水果、蔬菜是酵素常用原料，除此之外，還可添加菌菇、中草藥和藻類等進(jìn)行發(fā)酵，制備多種酵素產(chǎn)品。近年來，學(xué)者對酵素產(chǎn)品的發(fā)酵工藝和功能性進(jìn)行了較多研究，發(fā)現(xiàn)酵素食品普遍具有較好的抗氧化性和微生物多樣性，且隨著發(fā)酵程度的進(jìn)行，酵素食品中的抗氧化性和微生物多樣性呈現(xiàn)上升趨勢。

腸道菌群作為胃腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要組成部分，在維持機(jī)體健康等方面發(fā)揮著重要作用。在機(jī)體消化吸收過程中，營養(yǎng)攝取可導(dǎo)致腸道微生物系統(tǒng)發(fā)生變化[6]。研究表明，發(fā)酵食品會對機(jī)體腸道菌群多樣性產(chǎn)生影響，同時，也會帶來與機(jī)體糖分解有關(guān)的菌群改變、產(chǎn)短鏈脂肪酸(SCFAs)菌群豐度減小及蛋白質(zhì)分解菌群增多等變化[7]。

羊棲菜酵素是用羊棲菜和果蔬經(jīng)過多種菌種發(fā)酵得到的羊棲菜酵素，含有豐富的營養(yǎng)成分，具有良好的抗氧化活性和微生物多樣性[8]。目前,關(guān)于羊棲菜酵素與腸道微生物菌群之間的作用關(guān)系尚不明確[9]。酵素對小鼠腸道菌群影響是近年來關(guān)注的焦點(diǎn)，多項(xiàng)研究表明，酵素可能與腸道中的微生物群落構(gòu)成有關(guān)，能抑制腸道致病菌，促進(jìn)有益菌生長，優(yōu)化腸道菌群結(jié)構(gòu)，對健康產(chǎn)生積極意義[10]。本研究中，以灌胃羊棲菜酵素和灌胃生理鹽水的小鼠為研究對象，通過采集小鼠糞便對兩組小鼠的腸道菌群差異性進(jìn)行研究，并利用16S rRNA基因測序與代謝組學(xué)聯(lián)合應(yīng)用技術(shù)，研究羊棲菜酵素對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和代謝產(chǎn)物的影響，旨在揭示羊棲菜酵素與腸道微生物菌群之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)動物為SPF級昆明種小鼠100只，雄性，體質(zhì)量為(25±2)g，購自大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于室溫為(25±3)℃和濕度為40%～60%的遮光室內(nèi)鼠籠中，小鼠可自由飲水和取食。SPF級試驗(yàn)維持鼠糧購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。試驗(yàn)動物許可證號SYXK(遼) 2008-0002。

主要儀器：AB Triple TOF 5600/6600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)；低溫高速離心機(jī) (Eppendorf5430R)。色譜柱: ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm, 2.1 mm×100 mm column(Waters)；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm, 2.1×100 mm column(Waters)。

1.2 方法

1.2.1 羊棲菜酵素的制備 按照楊培青等[5]的方法加以改進(jìn)，即將羊棲菜、蘋果、梨、胡蘿卜、冬瓜洗凈并瀝干，切成1～3 cm見方的塊狀，取質(zhì)量分別為15.0、1.0、0.5、0.5、0.5 g混合，再將酵母、乳酸菌及醋酸菌加入混合物中，酵母、乳酸菌和醋酸菌的加入量均為混合物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的0.5%，于發(fā)酵罐中10～25 ℃下發(fā)酵50 d，即得羊棲菜發(fā)酵液。將所得羊棲菜發(fā)酵液過濾，濾液置于罐中貯藏30 d，即得羊棲菜酵素。

1.2.2 小鼠糞便的收集 將100只昆明種小鼠隨機(jī)分為空白組 (control-1～control-10)和羊棲菜酵素組(JS-1～JS-10)，每組設(shè)10個重復(fù)，每個重復(fù)5只小鼠。每天上午分別用生理鹽水(control)和羊棲菜酵素(JS)對各組小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃劑量均為0.2 mL/10 g(體質(zhì)量)，每日一次，連續(xù)灌胃45 d。最后一次灌胃24 h后，采用拎尾法收集各組糞便存放在離心管中，置于液氮中速凍后于-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 16S rRNA高通量測序及微生物多樣性分析將冷凍的小鼠糞便采用干冰送樣方法寄送至上海中科新生命生物科技有限公司，用于DNA的提取及測序，通過基因組DNA抽提、PCR擴(kuò)增、熒光定量、Illumina PE250測序?qū)⒌玫降腜E reads根據(jù)overlap關(guān)系進(jìn)行拼接。

對樣品進(jìn)行Chao1、Shannon、Simpson等Alpha多樣性指數(shù)分析，并計(jì)算樣品覆蓋率。OTU數(shù)量代表物種的豐度，利用Mothur軟件對每個樣品的OTU數(shù)量(相似水平97%以上)進(jìn)行計(jì)算[11]。

1.2.4 糞便代謝組學(xué)分析 取冷凍的小鼠糞便60 mg，分別加入200 μL水MP勻漿，渦旋60 s，加入800 μL甲醇-乙腈溶液(二者體積比為1∶1)，渦旋60 s，低溫超聲30 min，2次，-20 ℃下放置1 h沉淀蛋白質(zhì)，4 ℃下以14 000 r/min離心20 min，取上清液冷凍干燥，于-80 ℃下保存[12]。

樣品采用超高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent 1290 Infinity LC)進(jìn)行分離，色譜儀中柱溫為25 ℃，流速為0.3 mL/min，流動相為水+25 mmol/L 乙酸銨+25 mmol/L氨水(A相)，乙腈(B相)，在進(jìn)行梯度洗脫過程中，采用隨機(jī)樣本連續(xù)分析法進(jìn)行檢測和分析[13]。

1.2.5 代謝產(chǎn)物鑒定與分析 代謝結(jié)構(gòu)鑒定物的數(shù)據(jù)經(jīng)Pareto-scaling預(yù)處理后進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，即PLS-DA有監(jiān)督偏最小二乘法判別分析、無監(jiān)督主成分PCA分析和OPLS-DA正交偏最小二乘法判別分析。結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫選取潛在差異標(biāo)志物，結(jié)合相關(guān)生物標(biāo)志物，采用MetPA數(shù)據(jù)庫構(gòu)建代謝通路，對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析解釋[14]。其中，使用 OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in the projection，VIP)參數(shù)評價潛在的生物標(biāo)志物。選擇具有多維統(tǒng)計(jì)分析VIP>1和單變量統(tǒng)計(jì)分析P<0.05的代謝物，作為具有顯著性差異的代謝物[15]。將篩選出的差異代謝物進(jìn)行熱圖分析和利用Metaboanalyst數(shù)據(jù)庫進(jìn)行代謝通路分析。KEGG通路下包含的差異表達(dá)代謝物數(shù)目，在某種程度上反映試驗(yàn)設(shè)計(jì)中生物學(xué)處理對各個通路的影響程度，因此，結(jié)合兩方面因素選擇較為顯著的代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及差異表達(dá)代謝物進(jìn)行后續(xù)生物學(xué)機(jī)制研究[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌群多樣性分析

從表1可見：在所有樣品中，樣品OTU數(shù)量最多的為羊棲菜酵素灌胃JS-5組和JS-6組(均為1 319)，最少的為JS-1組(602)，表明各組菌群豐度存在顯著差異；Chao1值反映菌群多樣性程度，指數(shù)值越大表示菌群多樣性越高，樣品中菌群多樣性程度最高的為JS-5組(1 527)；Shannon指數(shù)反映菌群多樣性程度，指數(shù)值越大表示菌群多樣性越高，樣品中Shannon值最大的組也是JS-5組(5.46)；Simpson指數(shù)也反映菌群多樣性程度，數(shù)值越低表示菌群多樣性越高，樣品中JS-5組Simpson值最小(0.010 7)；20個樣品的覆蓋率均在0.99以上，說明小鼠糞便樣品中不能被檢測到的可能性較低。因此，從20組小鼠糞便菌群的OTU數(shù)量及Alpha多樣性可以看出，羊棲菜酵素灌胃組小鼠糞便菌群多樣性最高，表明羊棲菜酵素灌胃對小鼠的腸道菌群具有較為突出的調(diào)節(jié)作用。

表1 各組樣品糞便菌群的OUT數(shù)量及Alpha多樣性

2.2 菌群構(gòu)成

通過與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對OTU進(jìn)行物種分類并分別在門和屬水平上對各個樣品進(jìn)行了分析。從圖1可見：兩組小鼠腸道微生物種類繁多，在門水平上主要有6大類，分別是厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria、ε-細(xì)菌Epsilonbacteraeota和脫鐵桿菌門Deferribacteres，其中厚壁菌門和擬桿菌門是豐度比例最高的菌門；空白組中，厚壁菌門豐度為26.88%，放線菌門豐度為0.21%，而羊棲菜酵素組中，厚壁菌門豐度為43.00%，放線菌門豐度為4.74%，羊棲菜酵素灌胃組糞便菌群中厚壁菌門和擬桿菌門較空白組呈增加趨勢；空白組中，擬桿菌門、變形菌門、ε-細(xì)菌、脫鐵桿菌門的豐度分別為66.66%、2.79%、2.52%、0.53%，而羊棲菜酵素灌胃組中，擬桿菌門、變形菌門、ε-細(xì)菌、脫鐵桿菌門的豐度分別為48.91%、1.72%、0.85%、0.05%，羊棲菜酵素組糞便菌群中這4種菌門較空白組呈減少趨勢。這表明，羊棲菜酵素可選擇性地抑制腸道致病菌，促進(jìn)厚壁菌門和放線菌門等有益菌的生長，減少變形菌門、ε-細(xì)菌和擬桿菌門等有害菌、致病菌的比例。

圖1 各組樣品腸道菌群在門水平上的相對豐度

從圖2可見：在屬水平上，空白組和羊棲菜酵素組差異顯著；空白組中，鼠李科Muribaculaceae豐度為26.37%，乳桿菌屬豐度為5.27%，而羊棲菜酵素灌胃組中，鼠李科豐度為43.47%，乳桿菌屬Lactobacillus豐度為22.22%，羊棲菜酵素組糞便菌群中鼠李科、乳桿菌屬較空白組呈增加趨勢；空白組中，擬桿菌屬Bacteroides、毛騾菌科136組Lachnospiraceae NK4A 136 group、理研菌科RC9菌群Rikenellaceae RC9 gut group、幽門螺桿菌屬Helicobacter和雙歧桿菌屬Bifidobacterium豐度分別為16.22%、5.73%、7.89%、2.52%、0.048%，而羊棲菜酵素灌胃組中，擬桿菌屬、毛騾菌科136組、理研菌科RC9菌群、幽門螺桿菌屬和雙歧桿菌屬豐度分別為1.00%、2.97%、0.29%、0.85%、3.06%，羊棲菜酵素組糞便菌群中這6種菌屬較空白組呈減少趨勢。

圖2 各組樣品腸道菌群在屬水平上的相對豐度

2.3 糞便代謝組學(xué)分析

2.3.1 不同灌胃組間糞便樣本的分類信息 采用PLS-DA法分析空白組和羊棲菜酵素組小鼠的代謝物譜差異，正、負(fù)離子模式結(jié)果見圖3，其中兩組糞便樣本點(diǎn)在PC1維可以完全區(qū)分開，說明小鼠機(jī)體生理及物質(zhì)代謝狀況已經(jīng)發(fā)生了明顯的改變。為了驗(yàn)證PLS-DA 模型的可靠性，采用了OPLS-DA法對兩組樣本重新建模分析，結(jié)果得到較好的區(qū)分模型(圖4)。

圖3 空白組和羊棲菜酵素組小鼠糞便PLS-DA得分圖

圖4 空白組和羊棲菜酵素組小鼠糞便OPLS-DA得分圖

2.3.2 顯著性差異代謝物 選擇具有多維統(tǒng)計(jì)分析 VIP>1和單變量統(tǒng)計(jì)分析P<0.05的代謝物作為具有顯著性差異的代謝物。從表2可見：羊棲菜酵素灌胃組與空白組相比較，正、負(fù)離子模式下獲得的14種顯著差異潛在標(biāo)記物中，次黃嘌呤、4-氨基丁酸、黃嘌呤、黃腐酚、膽堿、甜菜堿、腺苷、麥芽三糖、尿嘧啶、脫氧肌苷、尿苷二磷酸葡萄糖、肌苷在小鼠糞便中含量上調(diào)(fold change>1)；而煙酰胺腺嘌呤二核苷酸、腺嘌呤、脫氧腺苷、ADP核糖、谷氨酸、硫胺素、甘氨酸、酪氨酸、α-D-葡萄糖、谷氨酸、肌酐、L-亮氨酸、尿苷在小鼠糞便中含量下調(diào)(fold change<1)。

表2 正、負(fù)離子模式下兩組的顯著差異代謝物

2.3.3 代謝通路分析 以P<0.05作為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)，同時根據(jù)試驗(yàn)整體條件篩選羊棲菜酵素灌胃小鼠糞便的代謝通路，最終從14條代謝通路中，篩選得到7條主要影響的代謝通路如圖5所示，分別為嘌呤代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，嘧啶代謝，半乳糖代謝，精氨酸和脯氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，精氨酸的生物合成,其中對前5個代謝通路的影響最為顯著。

圖5 差異代謝產(chǎn)物的主要代謝通路

3 討論

3.1 腸道菌群的變化

本研究中，不同灌胃組小鼠腸道菌群中起主要作用的微生物菌群不同，在羊棲菜酵素組中乳桿菌、雙歧桿菌比例升高，且為優(yōu)勢菌群。乳桿菌和雙歧桿菌是有益菌，是維持腸道細(xì)菌間生物拮抗作用的主要細(xì)菌，有助于腸道兼性菌的生長，同時能夠提高巨噬細(xì)胞的補(bǔ)體功能和吞噬活性，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫，減輕腸上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)腸道防御功能，對調(diào)節(jié)腸道菌群組成起到重要作用[16]。而羊棲菜酵素灌胃組擬桿菌、幽門螺桿菌等有害菌在腸道中的比例降低，這表明，羊棲菜酵素能夠顯著改善小鼠腸道菌群組成，抑制有害菌生長，并有益于優(yōu)勢腸道菌群的繁殖。

3.2 代謝通路的變化

3.2.1 嘌呤和嘧啶代謝 嘌呤和嘧啶代謝在胃腸道中具有顯著影響[17]。本研究中，羊棲菜酵素能夠升高小鼠糞便中肌苷、次黃嘌呤及黃嘌呤的含量，恢復(fù)機(jī)體嘌呤代謝的穩(wěn)態(tài)。肌苷為生物體的正常成分，是腺嘌呤的前體，能夠參與體內(nèi)核酸代謝、能量代謝和蛋白質(zhì)的合成。有研究表明，肌苷含量上調(diào)，表明肌苷能直接透過細(xì)胞膜進(jìn)入體細(xì)胞，活化丙酮酸氧化酶類，從而使處于低能缺氧狀態(tài)下的細(xì)胞能繼續(xù)順利進(jìn)行代謝，改善生物體能量代謝與蛋白質(zhì)的合成[18]。腸道菌群也參與嘌呤和尿酸的代謝，如負(fù)責(zé)嘌呤氧化代謝的關(guān)鍵酶黃嘌呤脫氫酶能夠由腸道細(xì)菌中的大腸桿菌分泌產(chǎn)生；腸道中的乳酸菌屬和假單胞菌屬的細(xì)菌能夠合成與尿酸分解代謝有關(guān)的一些酶；此外，腸道中的一些細(xì)菌還能夠分泌尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。研究表明，黃嘌呤含量上調(diào)，表明大腸桿菌分泌產(chǎn)生了大量的黃嘌呤脫氫酶，參與尿酸代謝，改善腸道菌群[19]。

本研究中還觀察到糞便內(nèi)容物中尿嘧啶水平降低、次黃嘌呤水平升高。尿嘧啶和次黃嘌呤是嘧啶和嘌呤衍生物，有研究表明, 尿嘧啶和次黃嘌呤水平的上調(diào)，表明腸道中菌群種類和數(shù)量的升高[20]。這表明，腸道菌群改善還會促進(jìn)核苷酸代謝的改善。有研究表明，動物在進(jìn)食期間，血漿中的尿苷水平會下降，該過程與肝臟中膽汁的分泌有關(guān)，肝臟可將血液中的尿苷運(yùn)送到膽汁中，膽汁則會被轉(zhuǎn)移到膽囊，然后被輸送到腸道，而腸道中的尿苷有助于葡萄糖的吸收[21]。本研究中，羊棲菜酵素能使小鼠糞便中的尿苷含量下調(diào)，表明尿苷實(shí)際上參與了葡萄糖的調(diào)節(jié)。此外，腸道中的尿苷還參與膽汁的再循環(huán)，得到重復(fù)利用，而不再返回至血液中。

3.2.2 氨基酸代謝 谷氨酸與蛋白質(zhì)及氨基酸代謝有關(guān)。谷氨酸缺乏是引起腸黏膜萎縮的主要原因，谷氨酸與精氨酸、脯氨酸等能經(jīng)過器官間復(fù)雜的新陳代謝實(shí)現(xiàn)相互轉(zhuǎn)換[22]。本研究中，羊棲菜酵素能使小鼠糞便中的中谷氨酸含量下調(diào)，推測小鼠體內(nèi)谷氨酸吸收充足，蛋白質(zhì)氨基酸代謝改善，能量代謝改善，腸道的完整性和免疫功能受到有益影響。胃腸道能夠在無中樞神經(jīng)系統(tǒng)支配條件下完成蠕動、分泌反射，該過程與氨基酸的代謝物密切相關(guān)[23]。有研究表明, 小鼠腸道中氨基酸含量升高，表明腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致炎癥發(fā)生[24]。本研究中，酪氨酸含量下降，表明糞便中代謝物發(fā)生顯著變化, 氨基酸吸收良好，氨基酸代謝得到改善。

3.2.3 糖代謝 腸道內(nèi)皮細(xì)胞間隙通透性可以通過黃腐酚修復(fù)和再生予以治療。在腸道中，黃腐酚具有強(qiáng)烈的抗炎作用，其不僅修飾炎癥激酶有利于抗氧化途徑，還可以阻斷腫瘤壞死因子等細(xì)胞損傷性炎癥通路中的激酶。此外，黃腐酚對腸黏膜的再生也較有幫助。本研究中，羊棲菜酵素能使小鼠糞便中的黃腐酚含量上調(diào)，表明黃腐酚及其衍生物改善了葡萄糖耐量，同時對膽汁酸分泌、組織炎癥和腸道微生物組成具有一定影響[25]。

以擬桿菌為代表的菌類, 能分解多種糖苷鍵[26]。本研究中，羊棲菜酵素能使小鼠糞便中的葡萄糖、核糖含量水平下降，這些單糖對某些腸道菌群來說是重要的能源物質(zhì)，單糖水平的變化表明了腸道菌群發(fā)生改善，本試驗(yàn)結(jié)果提示，小鼠腸道對糖類吸收功能明顯升高，表明酵素能夠改善小鼠體內(nèi)存在糖類和能量代謝的紊亂。

麥芽三糖可以快速進(jìn)入腸道，并產(chǎn)生大量益生菌[27]。本研究中，羊棲菜酵素能使小鼠糞便中的麥芽三糖含量上調(diào)，說明麥芽三糖可以維持小鼠腸道中益生菌的平衡，且能讓腸道中形成健康環(huán)境，可抑制有害病菌在腸道中繁殖，從而減少多種腸道病變的發(fā)生。

4 結(jié)論

1) 不同灌胃組小鼠腸道菌群中起主要作用的微生物菌群不同，在羊棲菜酵素組中乳桿菌、雙歧桿菌比例升高，且為優(yōu)勢菌群。

2) 羊棲菜酵素能夠顯著改善小鼠腸道菌群組成，抑制擬桿菌、幽門螺桿菌等有害菌生長，并有益于優(yōu)勢腸道菌群的繁殖。

3) 羊棲菜酵素對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)機(jī)制與嘌呤代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，嘧啶代謝，半乳糖代謝，精氨酸和脯氨酸代謝等代謝通路有關(guān)。