李 娜，陳鳳鳴，王 雷

（第四軍醫(yī)大學(xué)西京皮膚醫(yī)院，陜西 西安 710032）

病理檢查是診斷深部真菌病的重要手段，快速準(zhǔn)確檢出真菌對(duì)明確臨床診斷有著重要意義[1，2]。目前，真菌染色在我國臨床各類疾病診斷中應(yīng)用十分廣泛，如真菌感染的皮膚病、各內(nèi)科疾病的組織細(xì)胞染色以及重要臟器感染的診斷等[3-5]。多數(shù)真菌在常規(guī)蘇木素-伊紅染色切片上不容易辨認(rèn)，而PAS 染色是臨床中應(yīng)用最為廣泛的特殊染色方法[6]。由于組織內(nèi)都含有糖原，而研究發(fā)現(xiàn)，糖原的存在可導(dǎo)致一些深部真菌感染在進(jìn)行PAS 染色時(shí)因背景著色而影響觀察[7]。為此，本研究擬改進(jìn)PAS 染色方法，以降低染色背景。

1 材料與方法

1.1 試劑 10%鉻酸，堿性品紅，鹽酸，偏重亞硫酸鈉，活性炭，改良Gill 蘇木素染液，0.2%亮綠，1%鹽酸酒精，無水乙醇，二甲苯，中性樹膠。

1.2 染液配制 10%鉻酸氧化液：10 g 三氧化鉻加入90 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.5%高碘酸氧化液：0.5 g 高碘酸加入100 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，保存于4 ℃冰箱。0.2%亮綠：0.2 g 亮綠加入100 ml 蒸餾水中，搖勻使其完全溶解，加入0.2 ml 冰醋酸，保存于4 ℃冰箱。Schiff液：0.5 g 堿性品紅溶于100 ml 煮沸的蒸餾水中，煮沸5 min，溶液冷卻至50 ℃，加1 當(dāng)量鹽酸10 ml，待溫度冷卻至25 ℃時(shí)，加0.8 g 偏重亞硫酸鈉，搖蕩2 min，置于暗處18～24 h，加3 g 活性炭靜置1～2 h 過濾，溶液呈無色或淺草黃色可用。4 ℃避光密閉保存。

1.3 染色步驟 組織經(jīng)福爾馬林固定，切片厚4 μm，脫蠟至水。采用不同濃度的鉻酸溶液或高碘酸溶液氧化反應(yīng)10 min，蒸餾水洗滌3 次。用Schiff 液滴染15～60 min，傾去Schiff 試劑，流水沖洗。用亮綠染色液復(fù)染1 min，或者用改良Gill 蘇木素染液復(fù)染2～3 min，流水沖洗，返藍(lán)后常規(guī)酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.4 方法

1.4.1 比較亮綠與蘇木素襯染 取2 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片按上述染色步驟進(jìn)行染色，分別以亮綠與蘇木素襯染，比較菌絲及孢子與周圍組織對(duì)比是否分明，背景是否清晰。

1.4.2 比較不同濃度鉻酸溶液氧化后的染色 取3 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片，分為A、B、C 三組，按上述染色步驟進(jìn)行染色，A 組鉻酸溶液濃度5%，B 組鉻酸溶液濃度10%，C 組鉻酸溶液濃度20%，各氧化10 min，比較三組染色結(jié)果的陽性強(qiáng)度，陽性區(qū)域比周圍組織對(duì)比是否分明，背景是否清晰。

1.4.3 比較Schiff 溶液染色不同時(shí)間對(duì)結(jié)果的影響取3 張連續(xù)切片的深部真菌病染色切片，分為A、B、C 三組，以10%鉻酸溶液，按上述染色步驟進(jìn)行染色，A 組Schiff 溶液時(shí)間15 min，B 組Schiff 溶液時(shí)間30 min，C 組Schiff 溶液時(shí)間60 min，比較三組染色結(jié)果的陽性強(qiáng)度，陽性區(qū)域比周圍組織對(duì)比是否分明，背景是否清晰。

1.4.4 確立最終的改良條件 將濃度10%的鉻酸氧化10 min，Schiff 溶液染色30 min。采用多種真菌感染病理切片進(jìn)行驗(yàn)證染色方法是否可靠。取體癬、膿癬、以及深部真菌病各一張切片，以濃度10%的鉻酸，Schiff 溶液30 min 進(jìn)行染色，亮綠襯染，觀察皮膚組織內(nèi)的菌絲及孢子與周圍組織對(duì)比是否明顯，背景是否清晰。

2 結(jié)果

2.1 亮綠與蘇木素襯染比較 以常規(guī)PAS 染色比較亮綠與改良Gill 蘇木素染液襯染，發(fā)現(xiàn)蘇木素襯染背景為淡粉色，菌絲及孢子為紫紅色，與周圍組織不易區(qū)分。而亮綠襯染背景為綠色，菌絲及孢子為紫紅色與周圍組織對(duì)比明顯，易于辨認(rèn)，見圖1。

圖1 蘇木素與亮綠襯染的PAS 染色對(duì)比

2.2 不同濃度的鉻酸溶液氧化后染色效果比較 濃度為5%的鉻酸溶液組皮膚組織背景干凈清晰，但其中的菌絲及孢子著色偏淺，與周圍組織不易區(qū)分；濃度為10%的鉻酸溶液組皮膚組織內(nèi)的真菌著色呈紫紅色，顏色鮮艷，周圍的纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞為綠色能明顯區(qū)分，背景干凈清晰；濃度20%的鉻酸溶液背景干凈清晰，但其中的真菌不著色，未見明顯的菌絲及孢子，見圖2。

圖2 PAS-鉻酸染色不同濃度鉻酸溶液染色對(duì)比

2.3 Schiff 溶液染色不同時(shí)間的結(jié)果比較 Schiff 溶液15 min 組皮膚組織背景清晰，纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞為綠色，但菌絲及孢子著色偏淺；Schiff 溶液30 min 組皮膚組織背景清晰，纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞為綠色，菌絲及孢子為紫紅色；Schiff 溶液60 min組皮膚組織的背景較清晰，為綠色背景中夾雜著粉色，菌絲及孢子為紫紅色，見圖3。

圖3 PAS-鉻酸染色Schiff 溶液不同染色時(shí)間對(duì)比

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 采用濃度10%的鉻酸，Schiff 溶液30 min，并以亮綠襯染染體癬、膿癬、以及深部真菌病，可在組織內(nèi)見到染色對(duì)比度良好的真菌，證明該染色方法質(zhì)量可靠。PAS-鉻酸染色結(jié)果顯示體癬位于角質(zhì)層為紫紅色，其中的菌絲呈淡紫色對(duì)比明顯，易于辨認(rèn)；膿癬位于毛囊內(nèi)的孢子為淡紫色，而其中的角質(zhì)物質(zhì)為紫紅色，對(duì)比較明顯，易于辨認(rèn)；深部真菌病位于真皮的菌絲及孢子呈紫紅色，周圍纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞為綠色，對(duì)比明顯，易于辨認(rèn)，見圖4。

圖4 體癬、膿癬及深部真菌病PAS-鉻酸染色圖

3 討論

既往傳統(tǒng)的PAS-過碘酸染色采用的是蘇木素襯染[8，9]，該方法利用過碘酸作用將兩個(gè)相鄰碳的羥基氧化為醛基，而Schiff 試劑可與醛基發(fā)生染色反應(yīng)。目前，大量的實(shí)際真菌染色實(shí)驗(yàn)報(bào)道對(duì)PAS-過碘酸具體染色效果進(jìn)行了分析。如Margo CE 等[10]的研究報(bào)道了對(duì)傳染性結(jié)晶性角膜病變患者利用PAS-過碘酸染色進(jìn)行角膜組織液染色的研究，發(fā)現(xiàn)在部分患者的組織液樣本染色中能夠觀察到真菌，但在感染不強(qiáng)的患者中并不能獲得明顯的染色效果；Zaaroura H 等[11]對(duì)195例手足癬患者進(jìn)行了組織活檢染色，發(fā)現(xiàn)PAS-過碘酸染色呈陽性的患者僅有6例，且根據(jù)組織染色結(jié)果的反應(yīng)模式認(rèn)為這些患者不容易被歸類為具體的疾病類型；而Adriana GP 等[12]針對(duì)PAS-過碘酸染色進(jìn)行了系統(tǒng)性的效果分析，納入了皮膚、眼部以及其他真菌感染患者的組織樣本進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)雖然PAS-相鄰背景呈淡紅色，但從真菌與周圍組織的對(duì)比效果來看，有相當(dāng)一部分患者的樣本染色效果并不明顯，導(dǎo)致真菌感染情況不易辨認(rèn)。上述研究結(jié)果顯示，PAS-過碘酸染色方法在真菌染色的效果上并不十分理想。

從染色原理上來看，PAS-過碘酸染色具體的原理是將高碘酸作為氧化劑，氧化糖類及有關(guān)物質(zhì)中的1，2-乙二醇基，使之變?yōu)槎┡cSchiff 試劑結(jié)合生成一種品紅色化合物，于多糖存在的部位形成新的紫紅色復(fù)合物[13-15]。因此，PAS 染色能廣泛顯示糖原、膠原、基底膜帶，真菌孢子及菌絲較難分辨[16-18]。但由于該方法在真菌染色過程中暴露出的不穩(wěn)定性缺點(diǎn)，利用該方法無法為部分患者提供準(zhǔn)確的染色診斷效果[19，20]，而本研究通過將改良Gill蘇木素染液換為亮綠染液，背景為綠色，菌絲及孢子呈紫紅色，使染色效果更易于辨認(rèn)[21-23]。

本研究主要將過碘酸換成了鉻酸，主要原因如下：①鉻酸作為氧化劑時(shí)在多糖中產(chǎn)生醛類物質(zhì)，在濃度最高的區(qū)域完全轉(zhuǎn)化需要更長地時(shí)間，使這些多糖與Schiff 試劑反應(yīng)，這就意味著樣本組織內(nèi)的真菌將會(huì)獲得更長時(shí)間的染色反應(yīng)；②由于真菌的細(xì)胞壁富含1，2-乙二醇基團(tuán)，采用鉻酸來替代過碘酸可使真菌在組織切片上比大多數(shù)其他活性成分著色更強(qiáng)烈。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以觀察到，鉻酸使真菌和背景之間的對(duì)比往往比PAS-過碘酸染色的重復(fù)部分更明顯。以往國內(nèi)外也報(bào)道了關(guān)于PAS-過碘酸染色的改進(jìn)方法，如Chawla M 等[24]將PAS 染色和熒光成像分析結(jié)合應(yīng)用，可觀察到絨氈層和小孢子的具體發(fā)展進(jìn)程，但這種改進(jìn)方法并未對(duì)染色過程本身進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)際上并未獲得更好的染色效果。楊偉平等[25]利用50 ℃攤烤片機(jī)預(yù)處理與組織冷凍切片相結(jié)合的方法進(jìn)行真菌染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法明顯縮短了時(shí)間，且真菌薄膜染色對(duì)比度更加鮮艷，這種改進(jìn)方法避免了環(huán)境溫度對(duì)過碘酸產(chǎn)生的長時(shí)間影響，使染色能在3 min 內(nèi)達(dá)到較好效果。本研究將傳統(tǒng)PAS 染色中的過碘酸換成了鉻酸溶液，且研究了不同濃度的鉻酸溶液及Schiff 溶液不同的染色時(shí)間對(duì)PAS-鉻酸染色的影響，結(jié)果表明以10%濃度的鉻酸溶液及Schiff 溶液30 min 染色效果為最佳，此時(shí)皮膚組織中的真菌著色呈紫紅色，顏色鮮艷，與周圍的纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞能明顯區(qū)分，背景干凈清晰。在未考慮溫度因素的影響，利用鉻酸使Schiff 試劑與醛基之間獲得了更長的反應(yīng)時(shí)間，也收獲了類似的染色效果。

另外，本研究采用改良PAS-鉻酸染色，并以亮綠襯染，對(duì)皮膚科常見真菌感染性疾病體癬、膿癬，以及其他深部真菌病進(jìn)行驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)該染色方法的皮膚組織中的真菌著色呈紫紅色，背景呈綠色，與周圍的纖維結(jié)締組織及炎細(xì)胞能明顯區(qū)分，質(zhì)量可靠，對(duì)比度較高，可用于臨床檢測(cè)。

綜上所述，改良的PAS-鉻酸染色方法比經(jīng)典的PAS 染色方法背景更干凈，染色對(duì)比度較高。