王麗娟, 王 毅, 胡 青, 陸 斌, 李賢忠, 趙 川, 趙 敏, 馮發(fā)玉

(1.西南林業(yè)大學林學院，云南 昆明650224; 2.云南省林業(yè)和草原科學院云南省森林植物培育與開發(fā)利用重點實驗室/國家林業(yè)局云南珍稀瀕特森林植物保護和繁育重點實驗室，云南 昆明650201)

在自然條件下生長的植物經(jīng)常遭受干旱、水淹、高低溫、冷凍害、重金屬污染等非生物脅迫，嚴重影響其正常生長發(fā)育.為了適應(yīng)和抵消非生物脅迫對植物的影響，植物體自身建立了一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控的分子機制，通過相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達來調(diào)控下游基因表達，從而提高植物抗逆性.轉(zhuǎn)錄因子具有DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)、核定位信號區(qū)、寡聚化位點等結(jié)構(gòu).根據(jù)DNA結(jié)合域結(jié)構(gòu)的不同，又可分為乙烯響應(yīng)因子(AP2/ERF)、成髓細胞增生基因(MYB/MYC)、NAC(NAM、ATAF1/2、CUC2)、WRKYGQK七肽結(jié)構(gòu)蛋白(WRKYGQK heptapeptide structural protein, WRKY)、鋅指結(jié)構(gòu)蛋白(ZFP)和堿性螺旋—環(huán)—螺旋(bHLH)等家族[1].

WRKY是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與植物的各個生理過程，涉及生長、發(fā)育和自我應(yīng)激信號傳導(dǎo)或與不同的基因和轉(zhuǎn)錄因子交叉調(diào)節(jié)[2]，其具有特殊結(jié)構(gòu)，編碼的蛋白都含WRKYGQK七肽結(jié)構(gòu)，稱WRKY結(jié)構(gòu)域，每個家族成員包含1個或2個WRKY保守域，由60個氨基酸組成.C端通常為鋅指結(jié)構(gòu)C2H2(C-X4-5-C-X22-23-H-X-H)或C2HC(C-X7-C-X23-H-X-C)[3].根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)的類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可分為3類：第Ⅰ類包含2個WRKY域和1個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)；第Ⅱ類含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)，根據(jù)進化關(guān)系可細分成Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe等5類；第Ⅲ類包含1個WRKY結(jié)構(gòu)域和1個C2HC鋅指結(jié)構(gòu)[4].1994年在甘薯[Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill]中發(fā)現(xiàn)第1個WRKY轉(zhuǎn)錄因子cDNA結(jié)合蛋白(SPF1)后[5]，研究者相繼在水稻(OryzasativaL.)[6]、羅漢果[Siraitiagrosvenorii(Swingle) C. Jeffrey ex A. M. Lu et Z.Y. Zhang][7]等植物上鑒定得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子.根據(jù)近年來越來越多植物基因組數(shù)據(jù)的公布，發(fā)現(xiàn)高粱[Sorghumbicolor(L.) Moench]有97個WRKY基因家族成員[8]，甜菜(BetavulgarisL.)有40個[9]，油棕(ElaeisguineensisJacq.)有95個[10].大量研究證明了WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)答生物和非生物脅迫中起重要的調(diào)控作用[11].如：擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.]過表達WRKY14，以提高耐旱性[12]；玉米(ZeamaysL.)有58個WRKY基因受干旱脅迫誘導(dǎo)表達[13]；煙草(NicotianatabacumL.)過表達WRKY10，提高轉(zhuǎn)基因植株的耐旱和耐鹽性，表明該基因受多重脅迫的誘導(dǎo)表達[14].可見，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在許多植物中均已得到鑒定和分析，但目前對油橄欖(OleaeuropaeaL.)WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因和蛋白的鑒定與生物信息學分析的研究尚未見報道.

油橄欖為木犀科木樨欖屬的重要油料作物，原產(chǎn)于地中海沿岸半干旱氣候地區(qū)，該地區(qū)夏季長、熱、干燥，冬季溫和多雨[15].云南夏季濕潤多雨、冬季干旱的氣候與原產(chǎn)地氣候正好相反，且油橄欖栽培還面臨很多問題，因此選育抗旱、抗?jié)车恼枘酒贩N是解決云南油橄欖栽培問題瓶頸的關(guān)鍵.本研究旨在對油橄欖WRKY基因進行全基因組鑒定，分析其蛋白理化性質(zhì)、系統(tǒng)發(fā)育、分類、結(jié)構(gòu)、保守元件及基因表達譜.此外，本研究還進一步探究了油橄欖WRKY基因在干旱和水淹脅迫下的表達模式，探索油橄欖砧木品種‘TYZ-1號’抗旱、耐澇特性的作用機理，該研究結(jié)果可為油橄欖WRKY的功能和非生物脅迫反應(yīng)提供參考.通過了解WRKY轉(zhuǎn)錄因子在干旱和水淹脅迫下的分子機理，有利于選育和使用油橄欖抗旱、耐澇的砧木品種.

1 材料與方法

1.1 試驗材料的獲取

樣品采集于云南省林業(yè)和草原科學院樹木園，材料是‘佛奧’(原產(chǎn)意大利，是我國通過國家審定的油橄欖良種，中國油橄欖適生區(qū)大都有種植，且表現(xiàn)良好)和‘TYZ-1號’(是在綠化用油橄欖品種混合子培育出的實生苗中選取的優(yōu)良無性系)扦插苗在干旱、水淹脅迫及正常澆水下的根和葉.

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序

采集的根和葉當即處理后用液氮速凍后干冰保存送樣進行轉(zhuǎn)錄組測序，測序委托上海派森諾生物科技有限公司基于Illumina測序平臺進行測序.

1.3 油橄欖WRKY蛋白序列的獲取

油橄欖的全基因組數(shù)據(jù)從NCBI上下載，搜索獲得油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列和蛋白序列；利用NCBI進行BLAST同源序列比對及蛋白結(jié)構(gòu)域分析，除去無WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白序列及基因?qū)Φ膹?fù)制；利用KaKs_Calculator 2.0生物信息學分析軟件計算Ka、Ks和Ka/Ks，進而揭示基因家族受選擇情況.

1.4 油橄欖WRKY蛋白理化性質(zhì)的預(yù)測

利用ExPASy Protparam Tool在線軟件分析WRKY蛋白理化性質(zhì)，用NetPhos3.1 Service和DictyOGlyc 1.1 Service在線軟件預(yù)測氨基酸序列磷酸化和O-糖基化修飾情況，通過SignaIP-5.0和Euk-mPLoc 2.0 Server在線軟件預(yù)測蛋白的信號肽和亞細胞定位，利用Prabi在線軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)[10].

1.5 油橄欖蛋白進化樹、保守元件、基因結(jié)構(gòu)分析

從擬南芥基因數(shù)據(jù)庫(https://www.arabidopsis.org/)引入擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子，通過MEGA7和Figtree進化樹編輯軟件對油橄欖和擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白進行系統(tǒng)進化樹構(gòu)建及修飾，執(zhí)行參數(shù)為None.將油橄欖WRKY蛋白序列導(dǎo)入到DNAMAN分子生物學綜合應(yīng)用軟件中，進行多重序列比對.利用MEME(http://meme.nbcr.net/meme/tools/meme)在線軟件對106個油橄欖WRKY蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行預(yù)測，具體參數(shù)設(shè)置如下：重復(fù)次數(shù)選擇不限制，保守性基序的數(shù)目限制選擇10，其他參數(shù)均采用默認值.

1.6 油橄欖WRKY外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分布

利用NCBI在線軟件查詢外顯子位點和基因長度，計算外顯子長度和外顯子數(shù)，繪制基因外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)分布圖.

1.7 油橄欖WRKY水分脅迫基因表達譜的獲得

1.7.1 油橄欖水分脅迫試驗 試驗于2019年9月3日開始，采用1年生‘佛奧’和‘TYZ-1號’扦插苗為試驗材料，每個品種分為2組，每組10株，觀察其葉片變化.抗旱逆測定：在同一避雨環(huán)境條件下，分別對2個品種的扦插苗進行澆水處理，通過稱重的方式控制其田間持水量，此后不進行澆水，直至葉片枯死，觀察并記錄葉片變化.抗旱逆恢復(fù)測定：與抗旱逆測定進行相同的處理.當葉片出現(xiàn)卷曲時，對植株恢復(fù)正常澆水(5 d一次)，澆水后保證其正常田間持水量，觀察葉片變化.改變干旱處理為水淹處理，用同樣的方法進行抗?jié)衬鏈y定和抗?jié)衬婊謴?fù)測定.在每組重復(fù)試驗中隨機采集2個品種非生物脅迫及正常澆水下的3對根系和葉片，液氮速凍后干冰保存送樣進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因表達譜.

1.7.2 油橄欖WRKY參與水分脅迫基因的表達 將WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因表達譜數(shù)據(jù)錄入派森諾基因云在線軟件作基因表達交互熱圖.水分脅迫基因表達譜數(shù)據(jù)的處理及篩選采用每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的Fagments(FPKM)對表達量進行標準化，保留所有FPKM數(shù)據(jù)，對其進行排序，刪除FPKM無變化或者變化范圍不超過2倍的數(shù)據(jù)，篩選出基因表達量變化最大的15個基因.

2 結(jié)果與分析

2.1 油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員的基本信息

通過對油橄欖基因組中WRKY基因的搜索，共鑒定出107個成員，有2個成員具有相同的蛋白序列，原始基因組數(shù)據(jù)中的2個成員具有不同的蛋白登錄號和基因編號，但蛋白序列是一樣的，屬于相同的2個拷貝，故只保留了相同蛋白序列的1個基因，最后剩下106個油橄欖WRKY家族成員.利用KaKs_Calculator 2.0生物信息學分析軟件計算Ka、Ks和Ka/Ks，發(fā)現(xiàn)Ka>Ks，且Ka/Ks>1，P<0.05，表明油橄欖基因組在進化過程中受正向選擇.該106個蛋白所含氨基酸的大小為132～1 368 bp，平均氨基酸個數(shù)為357個.其中，油橄欖WRKY蛋白的氨基酸數(shù)目小于300個的基因序列有40個，數(shù)目為300～700個的基因序列有64個，數(shù)目大于700個的基因序列有2個.

2.2 油橄欖WRKY蛋白的理化性質(zhì)

利用ExPASy Protparam Tool在線軟件分析油橄欖WRKY蛋白的基本性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)在106個WRKY蛋白中有61個蛋白的理論等電點(PI)小于7，45個蛋白的PI大于7，PI最小值為4.81(WRKY103)，最大值為10.16(WRKY90)，平均值為7.13.油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族中有6個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，為穩(wěn)定蛋白，其余96個蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)大于40，為不穩(wěn)定蛋白，表明油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族大多為不穩(wěn)定蛋白.分析蛋白的親、疏水性，從油橄欖WRKY蛋白的脂肪族系數(shù)來看，該106個WRKY蛋白的脂肪族系數(shù)均小于100，表明其均為親水性蛋白，但從親水性平均系數(shù)來看，油橄欖WRKY蛋白的親水性不強.預(yù)測油橄欖WRKY氨基酸序列磷酸化和O-糖基化修飾情況，發(fā)現(xiàn)平均磷酸化位點有78.1個，O-糖基化位點平均有1.7個.在蛋白信號肽預(yù)測中發(fā)現(xiàn)106個WRKY蛋白都不存在信號肽.亞細胞定位顯示，106個WRKY蛋白均定位于細胞核中.通過Prabi在線軟件預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)所有油橄欖WRKY蛋白的二級結(jié)構(gòu)均有4種，即α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)卷曲、延伸鏈，其中，以無規(guī)則卷曲為主要結(jié)構(gòu)，α-螺旋為次要結(jié)構(gòu)，β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈所占比例較少.

2.3 油橄欖WRKY蛋白的系統(tǒng)進化樹

利用MEGA7進化樹編輯軟件對油橄欖106個WRKY轉(zhuǎn)錄因子及模式植物擬南芥的72個已知的WRKY蛋白進行系統(tǒng)進化樹分析.結(jié)果(圖1)顯示，油橄欖WRKY蛋白與擬南芥WRKY蛋白分類一致，分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類.第Ⅰ類成員最少，包含2個WRKY結(jié)構(gòu)域；第Ⅱ類成員最多，含有1個C2-H2鋅指結(jié)構(gòu)和1個WRKY保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)位點的不同，又將其分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe等5個亞類；第Ⅲ類含有1個WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個C2-HC鋅指結(jié)構(gòu).蛋白系統(tǒng)進化樹中的3個大類和5個亞類同時包含油橄欖和擬南芥的WRKY基因，表明擬南芥和油橄欖的WRKY家族在進化水平上具有較高的相似性.從進化樹分支關(guān)系可以看出，油橄欖3個大類的分支關(guān)系都較近，表明油橄欖WRKY基因家族在進化過程中的相似度越來越高.油橄欖WRKY七肽核心基序除了WRKYGQK外還含有WRKYGKK、WRKYNQK、WKKYRQK、WKKYGQK這4種變異類型.利用DNAMAN生物信息學分析軟件對油橄欖WRKY蛋白進行比對，結(jié)果(圖2)顯示：第Ⅰ類有2個WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域，第1個位點在984至991之間，第2個位點在1 214至1 221之間，鋅指結(jié)構(gòu)在WRKY保守結(jié)構(gòu)域后面；第Ⅱ類的1個WRKY結(jié)構(gòu)域位點在414至421之間；第Ⅲ類的1個WRKY保守結(jié)構(gòu)域位點在142至148之間；此外還有14個(WRKY8、WRKY22、WRKY28、WRKY41、WRKY47、WRKY58、WRKY65、WRKY82、WRKY85、WRKY86、WRKY87、WRKY90、WRKY93、WRKY100)異常結(jié)構(gòu)基因單獨歸為一類，它們都具有WRKY結(jié)構(gòu)域，但鋅指結(jié)構(gòu)不一樣，這些異常的WRKY蛋白被歸為Ⅳ類.然而，這些蛋白可能代表假基因或測序和裝配錯誤[16].

系統(tǒng)進化樹包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個大類和Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe 5個亞類；At:擬南芥，Oe：油橄欖.圖1 油橄欖和擬南芥WRKY蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of WRKY proteins from olive and Arabidopsis

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別表示4類油橄欖WRKY蛋白；一致的基序在黃色框中突出，高度保守的氨基酸被顯示在黑色框中，保守較少的被顯示在藍色和粉色框中，而不相似的氨基酸被顯示在黑色文字中；在Ⅰ組蛋白中，紅線表示沒有顯示出來的保守度較低的間歇序列；Oe：油橄欖.圖2 油橄欖WRKY蛋白多重序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment of olive WRKY proteins

2.4 油橄欖WRKY的保守元件、基因結(jié)構(gòu)

通常情況下，含有相同元件的基因具有相似的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能.利用MEME在線軟件對油橄欖WRKY家族基因進行保守元件分析，得到相關(guān)性最高的10個元件.其中，基序1和基序3為油橄欖WRKY七肽保守結(jié)構(gòu)域，油橄欖WRKY基因除了WRKY2、WRKY5、WRKY59、WRKY69外都包含1～2個WRKYGQK七肽段區(qū)域，而WRKY2、WRKY5、WRKY59、WRKY69經(jīng)驗證后表明都屬于WRKY轉(zhuǎn)錄因子，但在進化過程中，其結(jié)構(gòu)域發(fā)生了變異，基序2和基序4均表示油橄欖WRKY家族的鋅指結(jié)構(gòu)，所有油橄欖WRKY基因都含有鋅指結(jié)構(gòu)，表明保守基序分析結(jié)果與系統(tǒng)進化樹比對結(jié)果一致.基序5、基序7和基序9為未知保守結(jié)構(gòu)域，基序5只分布于Ⅱa、Ⅱc、Ⅱd、Ⅱe類家族，基序7分布于Ⅰ、Ⅱb類家族，基序9分布于Ⅱd、Ⅲ類家族，這一情況體現(xiàn)了家族成員進化的保守性.

2.5 油橄欖WRKY的外顯子和內(nèi)含子

通過油橄欖基因組數(shù)據(jù)和NCBI在線軟件分析得到油橄欖WRKY基因外顯子的位點及分布.根據(jù)外顯子位點計算外顯子數(shù)和長度，得到油橄欖WRKY基因內(nèi)含子和外顯子的結(jié)構(gòu).WRKY61含有外顯子數(shù)最多(17個)，WRKY69含有外顯子數(shù)最少(1個)，平均每個油橄欖WRKY含外顯子數(shù)為3.94個，轉(zhuǎn)錄因子基因長度變化范圍為423 bp(WRKY69)至11 939 bp(WRKY55)，平均大小為1 912 bp.油橄欖WRKY基因家族的內(nèi)含子和外顯子結(jié)構(gòu)變化較大，這表明油橄欖基因組在長期進化過程中經(jīng)歷了較大的變異選擇.

2.6 油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子水分脅迫基因的表達譜

本課題組前期進行油橄欖水分脅迫(干旱、水淹)試驗，發(fā)現(xiàn)在相同的脅迫條件下，‘TYZ-1號’的抗旱能力和耐澇能力強于‘佛奧’.‘佛奧’的葉片在干旱脅迫第18天時開始出現(xiàn)枯死，第27天完全枯死；‘TYZ-1號’的葉片在第18天開始出現(xiàn)枯死，第36天完全枯死.根據(jù)該試驗結(jié)果，統(tǒng)計在正常澆水情況下及水分脅迫下2個品種葉片和根系的FPKM數(shù)據(jù)，得到油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子水分脅迫基因表達交互熱圖(圖3).從圖3可以看出：與正常澆水相比，‘TYZ-1號’在應(yīng)對干旱脅迫時，其葉片有40個WRKY基因表達為上調(diào)，占37.7%，66個基因表達為下調(diào)，占62.2%；根系有59個WRKY基因表達為上調(diào)，占55.6%，47個基因表達為下調(diào)，占44.3%.而‘佛奧’在應(yīng)對干旱脅迫時，其葉片有59個WRKY基因表達為上調(diào)，占55.6%，47個基因表達為下調(diào)，占44.3%；根系有60個WRKY基因表達為上調(diào)，占56.6%，46個基因表達下調(diào)，占43.3%.在水淹脅迫下，‘佛奧’根系有50個WRKY基因表達為上調(diào)，占47.1%，56個基因表達為下調(diào)，占52.8%；葉片有75個WRKY基因表達為上調(diào)，占70.7%，31個基因表達為下調(diào)，占29.7%.而‘TYZ-1號’在應(yīng)對水淹脅迫時，其根系有55個WRKY基因表達為上調(diào)，占51.8%，51個基因表達為下調(diào)，占48.1%；葉片有44個WRKY基因表達為上調(diào)，占41.5%，62個基因表達為下調(diào)，占58.4%.圖3中，色塊的深淺表示基因表達量變化的大小，顯示在未受水分脅迫時，‘TYZ-1號’本底水平基因的表達量高于‘佛奧’，‘TYZ-1號’葉片有85個基因的表達量高于‘佛奧’，根系有60個基因的表達量高于‘佛奧’；在受到水分脅迫后，‘TYZ-1號’基因表達量的變化不顯著，色塊普遍較淺，而‘佛奧’中的深色塊多于‘TYZ-1號’，表明‘佛奧’基因上調(diào)或下調(diào)表達量較顯著.從水分(干旱、水淹)脅迫基因表達譜數(shù)據(jù)中篩選出15個抗旱相關(guān)基因(WRKY18、WRKY14、WRKY51、WRKY39、WRKY47、WRKY20、WRKY77、WRKY41、WRKY91、WRKY30、WRKY50、WRKY40、WRKY1、WRKY66、WRKY92)和15個水淹脅迫相關(guān)基因(WRKY14、WRKY51、WRKY37、WRKY1、WRKY77、WRKY66、WRKY4、WRKY91、WRKY21、WRKY103、WRKY94、WRKY96、WRKY74、WRKY92、WRKY65).其中，WRKY14、WRKY51、WRKY77、WRKY91、WRKY1、WRKY66、WRKY92在干旱和水淹脅迫下都起重要作用，基因表達量變化較大.

F表示‘佛奧’，O表示‘TYZ-1號’；D表示干旱，S表示水淹，N表示正常澆水；R表示根，L表示葉片；Oe表示油橄欖.圖3 油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子水分脅迫基因表達交互熱圖Fig.3 Interactive heat map of expressions of genes encoding WRKY transcription factors in olive under water stress

3 討論與結(jié)論

油橄欖基因組包含106個WRKY家族基因，大體分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類.隨著下一代測序技術(shù)的成熟，WRKY作為調(diào)節(jié)植物各種生理過程的轉(zhuǎn)錄因子之一，已在多種植物中被挖掘及鑒定，如向日葵(HelianthusannuusL.)基因家族包含117個WRKY轉(zhuǎn)錄因子[17],茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Ktze]含有56個[18]，枇杷[Eriobotryajaponica(Thunb.) Lindl.]含有33個[19]，石榴(PunicagranatumL.)含有69個[20]，海島棉(GossypiumbarbadenseLinn.)含有180個[21].本研究通過分析油橄欖基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了106個WRKY轉(zhuǎn)錄因子.WRKY家族中的轉(zhuǎn)錄因子數(shù)量不但與物種基因組有關(guān)，還與植物長期進化過程中受外界環(huán)境的影響有關(guān).與其他物種相比，油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量屬于中等類型，從這一結(jié)果可以推測，在油橄欖的自然進化過程中，WRKY基因家族受到一定的外部環(huán)境壓力.

本研究前期田間試驗的結(jié)果表明，‘TYZ-1號’表現(xiàn)出的抗旱性及耐澇性明顯強于‘佛奧’，這個性狀出現(xiàn)的原因有二：其一，‘佛奧’對水分脅迫的應(yīng)激表達過于劇烈，后期不能得到緩解，導(dǎo)致‘佛奧’不適應(yīng)水分脅迫；其二，未受水分脅迫時，‘TYZ-1號’基因本底表達量高于‘佛奧’，這表明‘TYZ-1號’可能一直處于防御狀態(tài)，在脅迫中能很好地做出應(yīng)答.本研究篩選出15個干旱脅迫相關(guān)基因和15個水淹脅迫相關(guān)基因，發(fā)現(xiàn)有7個相同的基因(WRKY14、WRKY51、WRKY77、WRKY91、WRKY1、WRKY66、WRKY92)共同調(diào)控干旱和水淹脅迫，這7個基因可能是水分脅迫調(diào)控的主要基因.查閱大量相關(guān)文獻發(fā)現(xiàn)，關(guān)于調(diào)控水淹脅迫的WRKY轉(zhuǎn)錄因子鮮見報道，此類轉(zhuǎn)錄因子在水淹脅迫下的作用機制尚不清楚，有待進一步研究.但關(guān)于調(diào)節(jié)抗旱機制的WRKY轉(zhuǎn)錄因子報道有很多，如：擬南芥WRKY48、WRKY57參與了干旱調(diào)控[22]；小麥(TriticumaestivumL.)WRKY16、WRKY24參與了干旱調(diào)控[23]；小麥WRKY2、WRKY19轉(zhuǎn)基因到擬南芥中，提高了擬南芥的抗旱能力[24]；擬南芥中過表達的水稻W(wǎng)RKY45提高了擬南芥的耐旱性[25]；水稻中過表達的WRKY11增強了耐旱性[26]；大豆WRKY35基因增強了煙草的耐旱能力[27]；擬南芥中過表達的大豆WRKY13、WRKY21、WRKY54增強了擬南芥的非生物脅迫能力[28]；大麥(HordeumvulgareL.)WRKY38提高了抗旱能力[29]；小麥WRKY44過表達到煙草中可提高煙草的耐旱性[30]；遏藍菜WRKY53提高轉(zhuǎn)基因煙草(NicotianatabacumL.)的抗旱能力[31].將這些轉(zhuǎn)錄因子與油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果(附件圖Ⅰ，掃OSID碼可見)顯示，15個抗旱相關(guān)因子在系統(tǒng)進化樹中并沒有全部聚在同一分支上，但小麥WRKY2、小麥WRKY19、大麥WRKY38、大豆WRKY21這4個基因與上述篩選出的7個油橄欖抗性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子中的4個(WRKY14、WRKY51、WRKY91、WRKY92)屬于同一分支，油橄欖這4個轉(zhuǎn)錄因子與小麥WRKY2、小麥WRKY19、大麥WRKY38、大豆WRKY21的相似度更高，推測油橄欖WRKY14、WRKY51、WRKY91、WRKY92與植物干旱脅迫的關(guān)系更為密切.作為核蛋白，小麥WRKY2、WRKY19的表達受干旱脅迫和脫落酸(ABA)誘導(dǎo)表達[24]，油橄欖WRKY92與其相似度較高，并且在干旱脅迫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，推測油橄欖WRKY92通過調(diào)節(jié)內(nèi)源激素脫落酸的表達水平使其進入生長停滯或半停滯狀態(tài)以抵御干旱脅迫，這與油茶干旱脅迫響應(yīng)機制[32]一致.已有研究表明在不同程度的水分脅迫下，油橄欖葉肉細胞中脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量隨脅迫程度的加劇而變化[33]，不同品種油橄欖在水分脅迫下的脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白含量變化不同，而脯氨酸含量與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)活性有一定的相關(guān)性.本課題組前期試驗結(jié)果表明，‘TYZ-1號’抗旱性強于‘佛奧’，這個結(jié)果可推測‘TYZ-1號’抗性相關(guān)基因WRKY14、WRKY51、WRKY91、WRKY92可能通過調(diào)節(jié)細胞中脯氨酸、丙二醛、可溶性糖和可溶性蛋白的含量來抵御脅迫的危害，但具體的代謝通路需要進一步分析驗證.

水分脅迫下的基因表達譜數(shù)據(jù)顯示，油橄欖WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同脅迫(干旱、水淹)及不同部位(根、葉)的基因表達量均存在差異，這表明油橄欖WRKY基因參與了對水分脅迫的響應(yīng).基因表達譜數(shù)據(jù)顯示，在油橄欖葉片和根系響應(yīng)干旱脅迫時，根系基因表達量總是高于葉片，這個結(jié)果表明根系作為植物吸收水分和各種養(yǎng)分的重要器官，受到干旱脅迫時，首先會對逆境做出應(yīng)答.