賈錚 徐任 張文新 黃杰★ 曲守方★

微衛(wèi)星（Microsatellite）是指人類基因組中的短串聯(lián)重復(fù)序列，有單核苷酸、雙核苷酸或高位核苷酸的重復(fù)。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是細(xì)胞內(nèi)的微衛(wèi)星由于重復(fù)單位的插入或缺失而導(dǎo)致微衛(wèi)星長(zhǎng)度的改變，包括微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（Microsatellite insta?bility?high，MSI?H）、微衛(wèi)星低度不穩(wěn)定（Microsat?ellite instability ?low，MSI?L）及微衛(wèi)星穩(wěn)定（micro?satellite stability，MSS）等狀態(tài)，是由錯(cuò)配修復(fù)（Mismatch repair，MMR）基因MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2發(fā)生缺陷引起的，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)［1?2］。臨床上已將MSI 作為結(jié)直腸癌及其他實(shí)體瘤預(yù)后和制定輔助治療方案的重要分子標(biāo)志物，并用于林奇綜合癥（Lynch syndrome）篩查［3?4］。美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)PD?L1 抑制劑帕博利珠單抗注射液（Keytruda 或Pembrolizum?ab），用于治療微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定（MSI?H）或錯(cuò)配修復(fù)基因缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）的實(shí)體瘤患者［5］，這是首款依照分子標(biāo)記物進(jìn)行區(qū)分的抗腫瘤療法。

目前臨床檢測(cè)MSI，主要是使用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)腫瘤組織中錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達(dá)［6?7］，和國(guó)際公認(rèn)的金標(biāo)準(zhǔn)?多重?zé)晒釶CR 結(jié)合毛細(xì)管電泳方法檢測(cè)特異的微衛(wèi)星重復(fù)序列擴(kuò)增判定MSI 狀態(tài)［8?9］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)（High throughput sequencing）發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成為MSI 檢測(cè)的新發(fā)展方向［10?12］。國(guó)內(nèi)已經(jīng)有多家公司開發(fā)基于高通量測(cè)序平臺(tái)的MSI 檢測(cè)試劑盒。本研究使用微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)國(guó)家參考品作為統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)MSI 檢測(cè)試劑盒（高通量測(cè)序法）的性能。

1 材料與方法

1.1 參考品

MSI 檢測(cè)國(guó)家參考品，批號(hào)：360028?201901，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑與儀器

人類多基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法），購(gòu)自江蘇先聲醫(yī)療器械有限公司。Genom?ic DNA Reagents、D1000 Reagents 和D1000 Screen?Tape，購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies 公司。NextSeq 500/550 High Output Reagent Cartridge v2（300 cy?cles）、NextSeq 500/550 Buffer Cartridge v2、NextSeq Accessory Box v2、NextSeq 500/550 High Output Flow Cell Cartridge v2.5購(gòu)自美國(guó)illumina公司。

ME220 超聲打斷儀，購(gòu)自美國(guó)Covaris 公司。4 200 TapeStation 片段分析系統(tǒng)，購(gòu)自美國(guó)Agilent Technologies 公司。NextSeq550Dx 基因測(cè)序儀，購(gòu)自美國(guó)illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 文庫(kù)構(gòu)建

取不少于100 ng 國(guó)家參考品DNA，轉(zhuǎn)移到Covaris 超聲打斷管中，設(shè)置超聲打斷儀各參數(shù)后進(jìn)行DNA 片段化處理。然后將片段化DNA 進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，制備文庫(kù)。

1.3.2 雜交捕獲

采用試劑盒具有特定DNA 序列的捕獲探針與文庫(kù)進(jìn)行雜交，從而特異性捕獲目標(biāo)區(qū)域，通過磁珠法富集被探針捕獲的目標(biāo)區(qū)域DNA 片段。將捕獲文庫(kù)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。純化后的文庫(kù)使用Agilent 4200 TapeStation 進(jìn)行檢測(cè)，要求主要片段的峰值為220 bp～350 bp 左右，無(wú)明顯小片段和大片段雜峰，主要片段的濃度應(yīng)>3 ng/μL。然后獲得合格的文庫(kù)。

1.3.3 上機(jī)測(cè)序

將已定量合格的文庫(kù)加入到試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化文庫(kù)試劑和磁珠懸浮緩沖液，經(jīng)過洗脫緩沖液的洗脫，獲得標(biāo)準(zhǔn)化文庫(kù)。標(biāo)準(zhǔn)化文庫(kù)加入到NextSeq 500/550 High Output Reagent Cartridge v2（300 cy?cles）中，配合NextSeq 500/550 Buffer Cartridge v2、NextSeq Accessory Box v2、NextSeq 500/550 High Output Flow Cell Cartridge v2.5，使用NextSeq550Dx基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。使用“人類多基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒分析軟件”對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得樣本的MSI 結(jié)果。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)陰性樣本構(gòu)建的MSI 基線（Baseline），從下機(jī)數(shù)據(jù)的bam 文件中分析樣本的微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)。對(duì)每個(gè)樣本給出微衛(wèi)星不穩(wěn)定的位點(diǎn)數(shù)目（如果位點(diǎn)的Distance>0.08 且P<0.01，則該位點(diǎn)是MSI 不穩(wěn)定位點(diǎn)）和可用的MSI 位點(diǎn)數(shù)，計(jì)算MSI值，其公式為：MSI 值=MSI 不穩(wěn)定位點(diǎn)數(shù)/可用的MSI 位點(diǎn)數(shù)×100%。當(dāng)樣本的MSI 值大于等于15%時(shí)結(jié)果為MSI?H，MSI 值小于15%時(shí)結(jié)果為MSS。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用python 3.7 中math、np 和scipy 包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算待測(cè)樣本與MSI 基線樣本間以及MSI 基線樣本間的Jensen?Shannon（JS）距離（Dis?tance），2 組Distance 數(shù)據(jù)間比較采用單邊t檢驗(yàn)進(jìn)行分析（P），以P<0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 陽(yáng)性參考品結(jié)果

國(guó)家參考品中的16 對(duì)陽(yáng)性參考品共32 例樣本檢測(cè)結(jié)果顯示均為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定，見表1。以國(guó)家陽(yáng)性參考品MSI?3 及其配對(duì)參考品MSI?3?對(duì)照（MSI?3?DZ）的chr2：16083525 位點(diǎn)的結(jié)果為例，見圖1。在MSI?3?DZ 和基線樣本中堿基重復(fù)數(shù)（Repeat?Length）集中分布在15 個(gè)串聯(lián)重復(fù)T上，在MSI?3 中12 個(gè)串聯(lián)重復(fù)T 上也有一個(gè)較高的峰值，表明該位點(diǎn)發(fā)生了微衛(wèi)星不穩(wěn)定，計(jì)算該位點(diǎn)的重復(fù)單元長(zhǎng)度與基線樣本的Distance 為0.2083 且P為0.0000（Distance>0.08 且P<0.01），結(jié)果為該位點(diǎn)是微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)。MSI?3?DZ 的該位點(diǎn)的Distance 為0.0551 且P為0.0004，結(jié)果為該位點(diǎn)是微衛(wèi)星穩(wěn)定位點(diǎn)。軟件分析國(guó)家陽(yáng)性參考品MSI?3 的MSI 值為72.38%（76/105），結(jié)果為MSI?H；MSI?3?DZ 的MSI 值為1.87%（2/107），結(jié)果為MSS。

表1 MSI 國(guó)家參考品的結(jié)果Table 1 The results of national reference MSI

圖1 國(guó)家陽(yáng)性參考品MSI?3 及其配對(duì)參考品MSI?3?對(duì)照的結(jié)果（chr2：16083525）Figure 1 The results of national positive reference MSI?3 and its matched reference MSI?3?control（chr2：16083525）

2.2 陰性參考品結(jié)果

國(guó)家參考品中的3 對(duì)陰性參考品共6 例樣本檢測(cè)結(jié)果顯示均為微衛(wèi)星穩(wěn)定，見表1。以國(guó)家陰性參考品MSI?19 及其配對(duì)參考品MSI?19?對(duì)照（MSI?19?DZ）的chr2：16083525 位點(diǎn)的結(jié)果為例，見圖2。MSI?19 和MSI?19?DZ 與基線樣本的分布情況相近，堿基重復(fù)數(shù)均集中分布在15 個(gè)串聯(lián)重復(fù)T 上，計(jì)算該位點(diǎn)的Distance 和P，結(jié)果為該位點(diǎn)是微衛(wèi)星穩(wěn)定位點(diǎn)。軟件分析國(guó)家陰性參考品MSI?19 的MSI 值為9.73%，MSI?19?DZ 的MSI 值為8.00%，結(jié)果均為MSS。

圖2 國(guó)家陰性參考品MSI?19 及其配對(duì)參考品MSI?19?對(duì)照的結(jié)果（chr2：16083525）Figure 2 The results of national negative reference MSI?19 and its matched reference MSI?19?control（chr2：16083525）

2.3 檢測(cè)限參考品結(jié)果

國(guó)家參考品中的6 組檢測(cè)限參考品共24 例樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品均能正確檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，而對(duì)5%腫瘤DNA 含量的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定性狀態(tài)的LOD1 及LOD3 檢測(cè)限參考品未能正確檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)，見表1。以國(guó)家檢測(cè)限參考品MSI?LOD3?20%、MSI?LOD3?10%、MSI?LOD3?5%及其配對(duì)參考品MSI?LOD3?對(duì)照（MSI?LOD3?DZ）的chr22：29682881 位點(diǎn)的結(jié)果為例，見圖3。MSI?LOD3?5%和MSI?LOD3?DZ 的MSI 值分別為9.09%和1.06%，結(jié)果為MSS。

3 討論

與傳統(tǒng)PCR 方法相比，高通量測(cè)序技術(shù)具有通量高、靈敏度強(qiáng)和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本中多個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)和多個(gè)疾病相關(guān)基因同時(shí)檢測(cè)，能夠輔助腫瘤診斷、預(yù)后評(píng)估或選擇治療方案。2017年11月16日，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)紀(jì)念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，簡(jiǎn)稱MSK）基于高通量測(cè)序技術(shù)的癌癥基因檢測(cè)分析平臺(tái)MSK?IMPACTTM，能夠一次對(duì)病人腫瘤468個(gè)基因的突變進(jìn)行檢測(cè)，并且可以檢測(cè)MSI基因組特征，但僅限于在MSK 中進(jìn)行使用，其檢測(cè)結(jié)果不與任何藥物聯(lián)用［13］。2017年11月30日，美國(guó)FDA 批準(zhǔn)了Foundation Medicine 公司針對(duì)多種實(shí)體瘤的二代測(cè)序的體外檢測(cè)產(chǎn)品—FoundationOne CDx（F1CDx），僅允許在Foundation Medicine 公司進(jìn)行檢測(cè)。該產(chǎn)品可以檢測(cè)5 種腫瘤中的324 個(gè)基因的突變，也可以檢測(cè)MSI和腫瘤突變負(fù)荷（TMB）兩個(gè)基因組特征，是FDA 批準(zhǔn)的首款獲得突破性認(rèn)定的癌癥高通量測(cè)序體外診斷檢測(cè)產(chǎn)品［14?15］。國(guó)內(nèi)已有多個(gè)公司在基于高通量測(cè)序平臺(tái)的腫瘤大Panel 檢測(cè)中加入MSI 檢測(cè)流程，進(jìn)行試劑盒的開發(fā)和應(yīng)用。國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）在2021年1月批準(zhǔn)常州桐樹生物科技有限公司的微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）檢測(cè)試劑盒（多重?zé)晒釶CR?毛細(xì)管電泳法），可以體外定性檢測(cè)結(jié)直腸癌患者腫瘤組織FFPE 樣本的“2B3D”（BAT?25、BAT?26、D5S346、D2S123、D17S250）微衛(wèi)星位點(diǎn)狀態(tài)，但是尚未批準(zhǔn)基于高通量測(cè)序法的MSI檢測(cè)試劑盒。

為了更好評(píng)價(jià)上市前的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)試劑盒（高通量測(cè)序法）的性能，建立標(biāo)準(zhǔn)化的國(guó)家參考品是非常有必要的。本院建立的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測(cè)國(guó)家參考品，是腫瘤組織或者細(xì)胞系和相應(yīng)的配對(duì)樣本，包括MSI?H、MSI?L 及MSS 三種狀態(tài)，其中微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定的陽(yáng)性參考品涵蓋了不同的微衛(wèi)星不穩(wěn)定位點(diǎn)，檢測(cè)限參考品設(shè)置20%、10%、5%三種不同腫瘤DNA 含量［16］。MSI 國(guó)家參考品采用國(guó)際公認(rèn)的MSI 金標(biāo)準(zhǔn)方法：多重?zé)晒釶CR?毛細(xì)管電泳法進(jìn)行標(biāo)定，給出相應(yīng)的MSI 狀態(tài)，要求高通量測(cè)序法的結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)方法的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，因此也適用于高通量測(cè)序法。對(duì)國(guó)家參考品62 例樣本的結(jié)果顯示，陽(yáng)性參考品的結(jié)果均為微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定，陰性參考品的結(jié)果均為微衛(wèi)星穩(wěn)定，20%和10%腫瘤DNA 含量檢測(cè)限參考品的結(jié)果均符合相應(yīng)的標(biāo)示結(jié)果，而對(duì)5%腫瘤DNA含量的微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定狀態(tài)的檢測(cè)限參考品LOD1 及LOD3 未能檢出正確結(jié)果。在臨床應(yīng)用中MSI 檢測(cè)限一般規(guī)定為20%腫瘤DNA 含量，國(guó)家參考品要求試劑盒對(duì)20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品必須檢出相應(yīng)的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性狀態(tài)；對(duì)5%腫瘤DNA 含量的檢測(cè)限參考品不作要求。建立的MSI 國(guó)家參考品，能夠適用于MSI 檢測(cè)試劑盒（高通量測(cè)序法）的性能評(píng)價(jià)。