馬甜甜 柳家翠 段怡平 陳梁玥 朱翠雯 鄒曉沨

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是全球第四大常見腫瘤，占全世界癌癥相關(guān)死亡人數(shù)的8.5%。腺癌為CRC 中最常見的病理類型。CRC在我國的發(fā)病率不斷上升，主要與經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來的生活方式和環(huán)境的改變有關(guān)，如三高一低（高熱量、高脂肪、高蛋白、低纖維）的西化生活方式［1］。早期CRC 患者的五年生存率可高達(dá)90%，由于缺乏早期診斷標(biāo)志物，大多數(shù)CRC 患者診斷時(shí)已處于晚期階段，其五年生存率降至70.4%［2］。因此，尋找CRC 發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)于CRC的診斷、治療及預(yù)后有著重要的意義。人類基因轉(zhuǎn)錄組僅有少數(shù)RNA 可作為蛋白質(zhì)合成的模板，超過70%的RNA 為非編碼RNA，對(duì)于細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及增殖分化起著非常重要的作用。其中，長度超過200 個(gè)核苷酸的非編碼RNA 稱為長鏈非編碼RNA（Long non?coding RNA，lncRNA）。研究表明，許多l(xiāng)ncRNA 在各種癌癥中表達(dá)失調(diào)，并與診斷和預(yù)后有關(guān)，例如，lncRNA HOXA?AS2在乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤中均有異常表達(dá)［3］，lncRNA DDX11?AS1在肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中出現(xiàn)高表達(dá)［4］。有研究表明，LINC00634通過miR?342?3p/Bcl2L1 軸在食管鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮致癌基因的作用［5］，但是LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制及與預(yù)后的關(guān)系尚未闡明。本研究通過分析TCGA 數(shù)據(jù)庫，探索LINC00634在CRC 中的表達(dá)、免疫浸潤及預(yù)后價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)的下載與處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫官方網(wǎng)站（http：//portal.gdc.cancer.gov/）下載結(jié)直腸RNA ?seq（level 3，HTSeq?FPKM）數(shù)據(jù)。其中包括CRC 組織樣本473 例，正常結(jié)直腸組織樣本41 例。對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，并Log2 轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。在TCGA 數(shù)據(jù)庫上下載并提取CRC 患者的臨床病理特征信息，刪除臨床信息缺失的樣本。

1.2 CRC 組織與正常組織之間的差異表達(dá)基因

使用R 4.0.2 軟件來篩選差異基因。將得到的差異基因繪制熱圖和火山圖。

1.3 LINC00634表達(dá)與臨床病理特征和預(yù)后的聯(lián)系

根據(jù)LINC00634在CRC 患者中表達(dá)值得中位數(shù)，將患者分為兩組。利用卡方檢驗(yàn)分析LINC00634與CRC 患者臨床特征的關(guān)系。利用Kaplan?Meier 法比較兩組之間總體生存的差異。使用Cox 回歸分析LINC00634的預(yù)后價(jià)值。

1.4 基因富集分析

采用基因富集分析（gene set enrichment analy?sis，GSEA）分析LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展中參與的信號(hào)通路。從Broad Institute 網(wǎng)站（http：//soft?ware.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）下載GSEA 分析軟件GSEA 4.1.0，分析通路來自Molecular Sig?nature Database（MsigDB）數(shù)據(jù)庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集。采用加權(quán)富集法分析，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)為1 000 次，所有其他參數(shù)均按默認(rèn)值設(shè)置。P值小于0.05 和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因。

1.5 免疫浸潤分析

使用R 4.0.2 軟件評(píng)估LINC00634表達(dá)與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤豐度的相關(guān)性。將473 例腫瘤樣本以中位數(shù)分為高、低表達(dá)組分析LINC00634對(duì)免疫系統(tǒng)微環(huán)境的影響。通過基于基因表達(dá)的反卷積算法CIBERSORT（http：//cibersort.stanford.edu/）評(píng)估各組之間基因表達(dá)的相對(duì)變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，將CRC 患者的年齡、性別、TNM 分期等臨床指標(biāo)進(jìn)行量化賦值，利用Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行單因素和多因素分析；生存分析采用KM 法；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)差異基因

篩選差異基因后共得到3 314 個(gè)差異表達(dá)基因（圖1），其中包含1 933 個(gè)上調(diào)基因和1 381 個(gè)下調(diào)基因。

圖1 差異表達(dá)基因Figure 1 Differentially expressed genes

2.2 LINC00634 在CRC 和正常組織中的表達(dá)

CRC 中LINC00634的表達(dá)水平與正常組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖2。

圖2 LINC00634 在CRC 組織中的表達(dá)分析Figure 2 Analysis of LINC00634 expression in colorectal cancer tissues

2.3 LINC00634 表達(dá)與CRC 患者臨床病理特征的聯(lián)系

LINC00634的表達(dá)水平與患者的年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)（P<0.05），見表1。臨床Ⅱ期患者LINC00634的表達(dá)水平與Ⅲ期患者相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖3A。發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者組LINC00634表達(dá)水平與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖3B～D。

圖3 LINC00634 表達(dá)量與CRC 患者臨床病理特征相關(guān)性分析Figure 3 Correlation analysis between LINC00634 expression and clinicopathological characteristics of colorectal cancer patients

表1 LINC00634 表達(dá)與CRC 患者臨床特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis between LINC00634 expression and clinical characteristics of colorectal cancer patients［n（%）］

2.4 LINC00634 表達(dá)與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系

高表達(dá)LINC00634組中患者的總體生存率低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖4。

圖4 LINC00634 的表達(dá)與CRC 患者預(yù)后的關(guān)系Figure 4 Expression and prognosis of LINC00634 in patients with colorectal cancer

年齡、Stage 分期、T 分期、M 分期、N 分期以及LINC00634均可作為預(yù)后因素，多因素Cox 回歸分析提示，年齡、T 分期和LINC00634可以作為CRC患者的獨(dú)立預(yù)后因素（P<0.05）。見表2。

表2 單因素和多因素Cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate Cox regression analysis

2.5 GSEA 功能富集分析

使用GSEA 功能富集進(jìn)一步了解LINC00634在CRC 發(fā)生發(fā)展過程中參與的信號(hào)通路，富集結(jié)果。見圖5。

圖5 GSEA 功能富集分析Figure 5 GSEA functional enrichment analysi s

2.6 LINC00634 表達(dá)與免疫浸潤

LINC00634表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞和靜止型NK 細(xì)胞正相關(guān)（R>0，P<0.05），與嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)（R<0，P<0.05），見圖6A。調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞在LINC00634高表達(dá)組中含量增加，而CD4+記憶T 細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞含量減少，見圖6B。相關(guān)性熱圖顯示，在CRC 中，CD8+T 細(xì)胞與M0 型巨噬細(xì)胞存在顯著的正相關(guān)性，而與CD4+記憶T 細(xì)胞存在顯著的負(fù)相關(guān)性。見圖6C。

圖6 LINC00634 表達(dá)與免疫浸潤Figure 6 Expression of LINC00634 and immune infiltration

3 討論

CRC 是一種發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌、胃癌、肝癌的惡性腫瘤，遺傳和環(huán)境因素對(duì)CRC 的發(fā)生發(fā)展有重要的影響［6］。CRC 早期無癥狀，大多數(shù)患者就診時(shí)已是晚期，治療及預(yù)后效果不佳。檢測(cè)外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞及其他與癌癥有關(guān)的腫瘤標(biāo)志物成本相對(duì)較低、侵入性更少，有利于CRC 的早期診斷［7］。已有研究表明mSEPT9、環(huán)狀RNA 等在CRC 患者血漿中特異性表達(dá)，可作為腫瘤標(biāo)志物用于CRC 的篩查和早期診斷［8?10］。

本研究結(jié)合多種生物信息學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)LINC00634在CRC 組織中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與患者的年齡、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。KEGG 通路分析表明，上調(diào)的LINC00634主要參與了DNA 復(fù)制，核苷酸切除修復(fù)，堿基切除修復(fù)，嘌呤、嘧啶核苷酸代謝，磷酸戊糖途徑，TGF 信號(hào)通路，ECM 受體相互作用通路等通路。DNA 損傷修復(fù)中核苷酸切除修復(fù)與堿基切除修復(fù)為重要的修復(fù)途徑，其通路中基因表達(dá)改變及基因功能的缺失與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［11］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展涉及大量的病理生理及生化過程，異常的代謝途徑，如嘌呤核苷酸代謝可通過調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響基因和蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移［12］，TGF 信號(hào)通路參與多種疾病的發(fā)生，包括肝癌、乳腺癌等，ECM1 是一種分泌性糖蛋白，與腫瘤發(fā)生、血管生成和表皮分化等密切相關(guān)，通過與顆粒蛋白前體（PGRN）相互作用參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13］。上調(diào)的LINC00634可能通過上述途徑在CRC 發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用，對(duì)癌癥的不良預(yù)后產(chǎn)生影響。

同時(shí)，本研究揭示了LINC00634表達(dá)與CRC免疫浸潤水平之間的聯(lián)系。不同免疫細(xì)胞的基因標(biāo)志物與LINC00634表達(dá)之間的關(guān)系暗示了LINC00634在調(diào)控結(jié)直腸腫瘤免疫微環(huán)境中的重要意義。結(jié)果顯示LINC00634表達(dá)與CD8+T 細(xì)胞、CD4+記憶T 細(xì)胞、M1 型巨噬細(xì)胞和靜止型NK 細(xì)胞正相關(guān)，而與嗜酸性粒細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)。這揭示LINC00634可能通過調(diào)節(jié)T 細(xì)胞與NK 細(xì)胞進(jìn)而影響CRC。研究表明腫瘤的轉(zhuǎn)移與免疫系統(tǒng)相關(guān)，T 細(xì)胞免疫功能失衡的患者更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移［14］，轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者體內(nèi)Th17 細(xì)胞增加，可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)免疫系統(tǒng)的耐受［15］。可以推斷，LINC00634過表達(dá)可以促進(jìn)T 細(xì)胞與NK 細(xì)胞的免疫反應(yīng)和浸潤，進(jìn)而影響CRC 的轉(zhuǎn)移與預(yù)后。

綜上所述，LINC00634在CRC 組織中表達(dá)顯著上調(diào)，調(diào)節(jié)了CRC 發(fā)生發(fā)展過程中免疫浸潤細(xì)胞及各種途徑中的蛋白質(zhì)，并與CRC 患者的惡性進(jìn)展相關(guān)，提示CRC 患者的不良總體生存預(yù)后，可以作為CRC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素。LINC00634有望成為CRC 新型分子標(biāo)志物和腫瘤治療的分子靶點(diǎn)。