劉玲玲，梅繼林，李 諾，李曉寧

(1.青島市婦女兒童醫(yī)院，山東 青島 266011; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040;3.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是脊髓最嚴重的并發(fā)癥之一，常因神經(jīng)元的不可逆丟失而導(dǎo)致嚴重的神經(jīng)功能障礙[1]。急性脊髓損傷病理復(fù)雜，可分為原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，損傷脊髓組織的修復(fù)是臨床的一大挑戰(zhàn)[2-3]。從時間進程上，SCI分為兩個階段。原發(fā)性損傷是對脊髓的初始機械損傷，繼發(fā)性損傷是由局部微環(huán)境改變引起的脫細胞化和神經(jīng)元壞死，隨后損傷部位明顯擴大至脊髓的更多節(jié)段[4]。越來越多的研究表明，神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致SCI后繼發(fā)性損傷的關(guān)鍵因素，而炎癥小體的激活又反過來引發(fā)了神經(jīng)炎癥[5-6]。炎性小體是一種多聚體蛋白復(fù)合物，由caspase-1、caspase活化募集域蛋白(ASC)和傳感器NLR蛋白(如NLRP1、NLRP2和NLRP3等)組成[7]。小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的巨噬細胞，因此是減少SCI后神經(jīng)炎癥的有前景的治療靶點[8]。大鼠SCI模型中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)NLRP3在小膠質(zhì)細胞中表達[9]，本課題組前期試驗也已經(jīng)驗證了NLRP3在SCI模型中的高表達[10]，NLRP3信號通路相關(guān)因子是否參與夾脊電針改善脊髓損傷大鼠的作用過程還有待驗證。

1 實驗材料

1.1 實驗動物及分組

Sprague-Dawley(SD)大鼠120只，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司。分為假手術(shù)組(Sham組)、模型組(Model組)、夾脊電針組(EA組)、P2X7干擾組(P2X7R siRNA)和干擾對照組(Control siRNA)共5組,各24只;每組又分1 d、3 d、7 d和21 d共4個時間點，實驗過程符合國際動物使用關(guān)懷標準。

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 儀器 石蠟切片機(德國Leica)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津泰斯特公司，DH36001B)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 (上海精宏實驗設(shè)備)；超純水系統(tǒng)(香港Heal Force)；激光共聚焦掃描顯微鏡(日本OLUMPUS)；電針儀(中國英迪KWD-808II)。

1.2.2 試劑 蘇木精(中國Solarbio);過氧化氫(中國國藥);DAB顯色液(中國Solarbio);山羊血清(中國Solarbio);cleaved caspase-1(中國Wanleibio);P2RX7(以色列alomone);IL-18(中國Bioss);HRP標記山羊抗兔IgG(美國thermofisher);OX42(美國abcam);FITC標記山羊抗小鼠IgG(中國Beyotime);Cy3標記山羊抗兔IgG(中國Beyotime);抗熒光衰減封片劑(中國Solarbio);P2X7慢病毒和陰性對照慢病毒(沈陽萬類生物科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備及評價

采用改良Allen’s打擊法制成脊髓損傷動物模型，予10%水合氯醛腹腔麻醉，大鼠麻醉之后將大鼠固定于手術(shù)臺上，以胸10為中心脫毛、備皮和消毒，以胸10棘突為中心切開3 cm手術(shù)切口，暴露胸9～11棘突。采用改良Allen’s打擊法，使脊髓組織出現(xiàn)急性損傷，隨后大鼠出現(xiàn)尾巴擺動，身體痙攣性抽搐，預(yù)示造模成功，再縫合傷口。術(shù)后給予生理鹽水，給予青霉素注射。大鼠蘇醒后通過BBB評分1～3分及下腹部觸診膀胱脹大確認造模成功[11]，使用BBB評分對大鼠后肢功能評分，1～3分納入本實驗。

2.2 干預(yù)方法

2.2.1 假手術(shù)組(Sham) 切除相應(yīng)椎板，僅僅暴露脊髓，但不打擊脊髓，同其它各組大鼠一同捆綁，常規(guī)飼養(yǎng)，不給予任何處置。

2.2.2 模型組(Model) 造模制備成功后，除正常捆綁外，不給予任何處理。

2.2.3 夾脊電針組(EA) 模型制備成功后3 h給予夾脊電針治療：華佗牌針灸針，直刺入胸9、胸11節(jié)段兩側(cè)夾脊穴下4～5 mm，并連接電針儀，將電針儀正負極接頭分別夾在同側(cè)夾脊穴兩針柄，定時30 min，電流輸出在1～2 mA，輸出頻率為100 Hz，每天治療1 次，每次30 min[12]。

2.2.4 P2X7干擾組(P2X7R siRNA) 脊髓損傷模型制作成功后，注射8 μL 滴度為107 TU/mL的P2X7R干擾慢病毒懸液，選取損傷部位頭端和尾端進行注射，各注射點注射2 μL病毒懸液。

2.2.5 干擾對照組(Control siRNA) 同P2X7干擾組注射陰性的對照慢病毒無其他處置。

2.3 指標檢測

2.3.1 BBB評定各組大鼠肢體運動功能 各組大鼠在造模成功后第1、3、7和21天運用BBB評分量表評定，評分最高21分，評分最低0分[13-14]，評分越低表示大鼠后肢運動障礙越嚴重。

2.3.2 免疫組化法檢測各組大鼠脊髓組織中NLRP3、ASC及IL-18的表達情況 固定后的脊髓組織修復(fù)，酒精脫水，二甲苯固定，包埋后切成層厚為5 μm的薄片，60℃溫箱中2 h，烘干，脫蠟，隨后進行IHC檢測。

2.3.3 免疫熒光雙標法檢測觀察NLRP3與OX42共定位 切片脫蠟至水：將每張石蠟切片置于切片架上，于60℃烘箱中烤片，分別浸于I級和II級二甲苯中，再依次浸入95%、85%和75%乙醇；抗原修復(fù)：置于煮沸抗原修復(fù)液中，低火修復(fù)；血清封閉：滴加山羊血清至完全覆蓋組織；一抗孵育：滴加一抗共同孵育；二抗孵育：滴加熒光二抗完全覆蓋組織；DAPI復(fù)染：滴加DAPI以復(fù)染核；抗熒光衰減封片：膠頭滴管滴加抗熒光衰減封片劑，封片；鏡檢[15]。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 BBB評分法觀察各組大鼠運動功能

與Sham組比較，各時間點Model組大鼠BBB評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與P2X7R siRNA組比較，3 d、7 d和21 d各時間點Control siRNA組大鼠BBB評分顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與Model組比較，術(shù)后3 d、7 d和21 d共3個時間點EA組和P2X7R siRNA組大鼠BBB評分均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著時間的推移，EA組和P2X7R siRNA組大鼠BBB評分表現(xiàn)為上升趨勢，表明EA組和P2X7R siRNA組都可以改善大鼠脊髓損傷后肢體功能，治療21 d時間點效果更顯著。見表1。

表1 各組大鼠治療前后BBB評分的變化

3.2 免疫組化法檢測各組大鼠脊髓組織相關(guān)因子表達變化情況

3.2.1 各組大鼠脊髓組織NLRP3表達變化比較 Sham 組大鼠脊髓組織中NLRP3表達量極低，與Sham組比較，各時間點Model組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功。與P2X7R siRNA組比較，3 d、7 d和21 d各時間點Control siRNA組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達水平仍較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。經(jīng)夾脊電針治療后，3 d、7 d和21 d EA組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，質(zhì)粒病毒裝載小片段RNA注射脊髓組織后，3 d、7 d和21 dP2X7R siRNA組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；見圖1、表2。隨著時間的推移，Model組與EA組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達在1 d、3 d和7 d表現(xiàn)為上升趨勢，7 d時表達量達到最高，21 d時出現(xiàn)下降趨勢，且EA組各時間點表達量始終低于Model組。結(jié)果表明脊髓損傷后微環(huán)境中NLRP3蛋白表達明顯升高，質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制NLRP3蛋白表達，夾脊電針也可抑制NLRP3蛋白的表達，進而可能抑制其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，治療脊髓炎性損傷，隨著時間增加，治療優(yōu)勢更明顯。

圖1 各組大鼠脊髓組織NLRP3表達的比較(400×)

表2 各組大鼠脊髓組織NLRP3的平均光密度值

3.2.2 各組大鼠脊髓組織ASC表達比較 Sham組大鼠脊髓組織中ASC蛋白表達量極低，與Sham組比較，各時間點Model組大鼠脊髓組織ASC蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功。與P2X7R siRNA組比較，3 d、7 d和21 d各時間點Control siRNA組大鼠脊髓組織ASC蛋白表達水平仍較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。經(jīng)夾脊電針治療后，3 d、7 d和21 d EA組大鼠脊髓組織ASC蛋白表達均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達后，3 d、7 d和21 d各時間點P2X7RsiRNA組大鼠脊髓組織ASC蛋白表達水平均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；見圖2、表3。隨著時間的推移，Model組與EA組大鼠脊髓組織ASC蛋白表達在1 d、3 d表現(xiàn)為上升趨勢，7 d、21 d時出現(xiàn)逐漸下降趨勢，且EA組各時間點表達量始終低于Model組,結(jié)果表明脊髓損傷后微環(huán)境中ASC表達蛋白顯著升高，夾脊電針和質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制ASC蛋白的表達，可能抑制NLRP3介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，減輕脊髓損傷炎性損傷。

表3 各組大鼠脊髓組織ASC的平均光密度值

圖2 各組大鼠脊髓組織ASC表達的比較(400×)

3.2.3 各組大鼠脊髓組織IL-18表達比較 Sham組大鼠脊髓組織中IL-18表達量極低，與Sham組比較，各時間點Model組大鼠脊髓組織IL-18表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明模型制備成功；與P2X7R siRNA組比較，3 d、7 d和21 d各時間點Control siRNA組大鼠脊髓組織IL-18表達水平仍較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明構(gòu)建干擾慢病毒載體成功。經(jīng)夾脊電針治療后，7 d、21 d EA組大鼠脊髓組織IL-18表達均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達后，3 d、7 d和21 d各時間點P2X7R siRNA組大鼠脊髓組織IL-18表達水平均低于Model組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；見圖3、表4。隨著時間的推移，Model組大鼠脊髓組織IL-18表達1 d、3 d逐漸升高，維持到7 d達到最高值，21 d出現(xiàn)緩慢下降的趨勢；EA組大鼠脊髓組織IL-18表達在1 d到3 d出現(xiàn)上升的趨勢，3 d達到最高值后7 d、21 d出現(xiàn)了顯著的表達下降趨勢。結(jié)果表明脊髓損傷后脊髓組織微環(huán)境中促炎因子IL-18的表達水平顯著升高，質(zhì)粒病毒siRNA干擾P2X7R能抑制促炎因子IL-18的分泌，夾脊電針也能抑制促炎因子IL-18的分泌，進而治療脊髓組織炎性損傷，隨著時間的增加，治療優(yōu)勢更加顯著。

表4 各組大鼠脊髓組織IL-18的平均光密度值

圖3 各組大鼠脊髓組織IL-18表達的比較(400×)

3.3 各組大鼠脊髓組織中NLRP3與OX42共定位表達

NLRP3與小膠質(zhì)細胞的標志物OX42免疫熒光雙染可見，NLRP3與OX42存在共定位，且紅色熒光為NLRP3陽性，綠色熒光為OX42陽性，藍色熒光為細胞核，雙陽性為橙色，與Sham組比較，各時間點Model組NLRP3與OX42共定位陽性表達明顯增多，夾脊電針治療后3 d、7 d和21 d EA組NLRP3與OX42共定位陽性表達明顯低于Model組，質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達后，3 d、7 d和21 d P2X7R siRNA組NLRP3與OX42共定位陽性表達明顯低于Model組，在4個時間點中，1 d、3 d和7 d時間點Model組和EA組NLRP3與OX42共定位陽性表達呈現(xiàn)上升趨勢，7 d時陽性表達最多，21 d陽性表達有下降趨勢。以上實驗結(jié)果表明脊髓損傷后NLRP3在脊髓組織小膠質(zhì)細胞中表達明顯增多，夾脊電針和質(zhì)粒病毒裝載siRNA干擾P2X7R表達能夠有效地抑制小膠質(zhì)細胞中的NLRP3表達起到抑制炎癥反應(yīng)的作用。見圖4。

圖4 各組大鼠脊髓組織中P2X7R與OX42共定位表達(600×)

4 討論

SCI遵循雙階段時間進程，初級損傷是由過度的機械撞擊直接導(dǎo)致的，導(dǎo)致椎體骨折，引起急性出血、壞死細胞死亡和神經(jīng)元丟失。繼發(fā)性損傷會導(dǎo)致彌漫性的、持久的損傷，這對膠質(zhì)細胞和神經(jīng)細胞具有破壞性，并引發(fā)延遲性細胞死亡和進行性神經(jīng)變性，隨后損傷部位顯著擴大到脊髓的更高節(jié)段[16-18]。炎癥是來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)先天免疫系統(tǒng)的一種反應(yīng)，在組織損傷后中樞神經(jīng)系統(tǒng)的病理中發(fā)揮重要作用,在SCI的繼發(fā)期發(fā)揮關(guān)鍵作用[19-20]。課題組前期已經(jīng)發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后NLRP3炎癥小體可以被激活并且引起一系列的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，夾脊電針可以減輕NLRP3炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進脊髓損傷后的肢體功能恢復(fù)，由于P2X7R是NLRP3炎性小體最有效的激活因子之一[21]，據(jù)此引入P2X7R抑制劑，增加P2X7R抑制劑組和對照觀察組，延伸觀察時間點，進一步探討在SCI大鼠中夾脊電針對NLRP3信號通路的作用機制。

炎癥反應(yīng)的啟動與“炎性小體”的多蛋白復(fù)合體的形成密切相關(guān)，炎癥小體是一種胞質(zhì)化的多蛋白復(fù)合物，作為細胞內(nèi)細胞穩(wěn)態(tài)破壞的傳感器，它們的刺激導(dǎo)致促炎細胞因子pro-IL-1b和pro-IL-18通過活化的caspase-1蛋白水解裂解。NLRP3炎性小體活性復(fù)合物由一個中心支架蛋白NLRP3結(jié)構(gòu)域、一個凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(包含caspase活化和招募結(jié)構(gòu)域CARD)ASC和caspase-1酶的前體形式pro-caspase-1組成。一般而言，每個炎性小體的3個主要區(qū)域是1個胞質(zhì)傳感器、1個接頭蛋白和1個效應(yīng)體半胱天冬酶。對NLRP3而言，細胞內(nèi)傳感器為NLRP3，接頭蛋白為ASC，Caspase-1是效應(yīng)體[22-23]。炎性小體的形成激活caspase-1，進而將pro-IL-1β和pro-IL-18裂解成成熟的IL-1β和IL-18[12]，炎性因子的成熟和分泌進而引起一些列的炎性反應(yīng)。小膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在中樞神經(jīng)損傷機制中發(fā)揮重要作用，脊髓損傷后，脊髓組織中的小膠質(zhì)細胞被大量激活，損傷后引起炎癥反應(yīng)進一步加重脊髓組織的繼發(fā)性損傷。因此調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化引起的炎癥反應(yīng)成為了治療脊髓損傷的重要切入點，小膠質(zhì)細胞活化介導(dǎo)的炎癥信號通路存在多條，其中離子門控制通道受體P2X7R是小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)炎癥表達極其重要信號通路。P2X7R是作為一種ATP門控型離子通道，脊髓損傷后細胞外ATP與P2X7R結(jié)合引發(fā)的寡聚化反應(yīng)，使離子通道迅速開放，產(chǎn)生K+外流，引起胞內(nèi)K+的迅速耗竭，進而激活NLRP3炎癥小體。有學(xué)者通過共聚焦顯微鏡和免疫共沉淀觀察P2X7R和NLRP3在小鼠小膠質(zhì)細胞和小鼠腹膜巨噬細胞表達和定位情況[24]。發(fā)現(xiàn)P2X7R通道或孔洞打開導(dǎo)致細胞內(nèi)離子微環(huán)境的局部修飾，從而驅(qū)動NLRP3炎性小體成分的募集，并促進其在P2X7R附近的自身組裝。同時有研究觀察到細胞內(nèi)K+濃度降低，質(zhì)膜通道(包括P2X7R)開放會激活NLRP3炎癥小體的活化，由此可見P2X7R離子門通道的打開是NLRP3活化的重要步驟。Gustin等研究結(jié)果表明，小鼠大腦中形成有功能的NLRP3炎性小體的能力僅限于小膠質(zhì)細胞，而不是的星形膠質(zhì)細胞[25]。同樣，在大鼠SCI模型中，NLRP3也被證實在小膠質(zhì)細胞中表達[20]。

本研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷后，模型組NLRP3、ASC及IL-18蛋白表達量增加，說明此信號通路的相關(guān)因子參與了脊髓損傷的機制，抑制劑組NLRP3、ASC和IL-18表達量均顯著降低，是由于特異性地抑制P2X7R的表達，從而減少微環(huán)境中NLRP3、ASC及IL-18的含量，抑制脊髓組織的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

由此可知夾脊電針能有效抑制NLRP3蛋白及基因的表達，進而可能減輕脊髓損傷的炎性損傷，這與課題組前期研究發(fā)現(xiàn)夾脊電針干預(yù)能抑制脊髓損傷組織NLRP3炎癥小體活化，進而抑制炎癥反應(yīng)結(jié)果相一致[10]，并且免疫熒光雙染結(jié)果也表明NLRP3在小膠質(zhì)細胞中表達，這與前人的研究結(jié)果一致[20]。

脊髓損傷后經(jīng)脈阻滯，氣血虧虛，肌肉痿廢不用，與“痿證”相契合，多歸屬于此?！梆簟敝^虛弱，無力以運動?！堆C論》曰：“痿者，足廢不能行之謂”；《馮氏錦囊秘錄》云：“痿者，手足痿軟無力，百節(jié)緩縱不收也”。脊髓損傷無外內(nèi)外因，外因主要由外傷所致，脊髓的位置及其生理、病理都與督脈密不可分。

夾脊穴最早的描述出現(xiàn)在《素問·刺瘧》曰:“十二瘧者,……又刺項以下俠脊者必已?！薄娥鹈浻窈狻酚涊d：“盛經(jīng)出血，又刺項以下挾脊者，必已”?！吨夂髠浼狈健吩唬骸傲钫?dāng)心厭，又夾脊左右一寸，各七壯”“去脊各一寸，灸之百壯”。針灸學(xué)家承淡安先生在著作《中國針灸學(xué)》將夾脊穴命名為“華佗夾脊穴”，并且精確了華佗夾脊穴的定位。穴位均位于脊柱兩側(cè)，左右對稱，夾脊穴從上到下形成與督脈平行的夾脊穴帶，位于足太陽膀胱經(jīng)和督脈的中間，承載著成為溝通兩條陽經(jīng)的紐帶，發(fā)揮著調(diào)理臟腑陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)氣血的關(guān)鍵作用[26]。從穴位解剖位置角度而言，每個夾脊穴處從淺到深涉及到皮膚、血管及局部肌肉外，還會有相應(yīng)的脊神經(jīng)和交感神經(jīng)伴行，針刺可以促進血液流動、緩解肌肉酸痛的作用，啟動神經(jīng)體液調(diào)節(jié)機制，分泌神經(jīng)末梢化學(xué)因子，改善相應(yīng)臟腑功能[27]。電針形成的電磁場又會強化夾脊針的作用，使其作用效果發(fā)揮到更大。

電針是一種在針灸針針柄位置連接電針治療儀的治療方法，將電刺激與傳統(tǒng)針刺相結(jié)合，增加了刺激強度。研究表明，電針治療SCI可能是增加神經(jīng)營養(yǎng)因子表達含量、增加內(nèi)源性神經(jīng)干細胞表達量、增加了患者脊髓的血流量、抑制堿性成纖維細胞生長因子在體內(nèi)合成、阻斷逆行性中樞神經(jīng)元損傷途徑、抑制脊髓損傷后Ca2+含量等[28]。夾脊電針將穴位治療及電針的雙重優(yōu)勢充分利用，對損傷部位活血化瘀，并且催發(fā)經(jīng)氣傳導(dǎo)，氣血流通，達到鎮(zhèn)痛，疏通督脈、膀胱經(jīng)氣和調(diào)理臟腑氣血的作用。

本實驗結(jié)果顯示：脊髓組織損傷的大鼠脊髓組織中的炎癥相關(guān)因子表達量增加，而夾脊電針可以降低炎癥因子的表達量，從而加快了脊髓損傷大鼠運動功能恢復(fù)。因此，夾脊電針改善脊髓損傷大鼠的運動功能，可能與抑制NLRP3信號通路相關(guān)炎癥因子表達有關(guān)。