李方文卉，唐宏圖，2△

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061；2.針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430061)

腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome，IBS)是常見(jiàn)的功能性胃腸病之一，臨床癥狀表現(xiàn)為腹部不適、腹痛并伴隨排便習(xí)慣的改變，其中以腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea predominant irritable bowel syndrome，IBS-D)最為常見(jiàn)[1]。該病在中國(guó)的患病率為5%～6%,隨著人們?nèi)粘ｏ嬍?、生活?xí)慣的改變，腸易激綜合征的患病率呈升高趨勢(shì)[2]。目前IBS-D的治療主要以傳統(tǒng)西醫(yī)常規(guī)治療為主，如解痙、止瀉和抗焦慮抑郁等[3]，其中服用匹維溴銨較為普遍，但療效較為一般。值得研究的是，中醫(yī)治療IBS日益顯示出其獨(dú)特的內(nèi)涵和優(yōu)勢(shì)，蘊(yùn)藏著較大的潛力，IBS已成為針灸治療的優(yōu)勢(shì)病種，療效確切[4-5]，而且配穴及組方多樣[6]。有研究表明，IBS患者的腸上皮緊密連接結(jié)構(gòu)遭到損壞，會(huì)出現(xiàn)腹瀉、大便性狀的改變[7]。本實(shí)驗(yàn)以IBS-D大鼠為研究對(duì)象，觀察經(jīng)標(biāo)本配穴電針干預(yù)后對(duì)IBS-D大鼠一般體征、內(nèi)臟高敏感性及腸組織形態(tài)學(xué)的影響，初步探討標(biāo)本配穴電針治療腹瀉型腸易激綜合征的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 aquaplus2系列艾科浦超純水制成機(jī)(美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司)；0.30 mm×13 mm華佗牌毫針；G6805-Ⅱ型電針治療儀(青島鑫升實(shí)業(yè)有限公司)；TGL-10B系列臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.1.2 西藥 匹維溴銨片，生產(chǎn)廠家:Abbott Healthcare SAS(法國(guó)),批準(zhǔn)文號(hào):H20160396,規(guī)格:50 mg×15片。

1.1.3 主要試劑 大鼠P物質(zhì)(SP)檢測(cè)試劑盒(Bogoo公司)，TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(德國(guó)默沙克)，INF-γ(eBioscience公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)采用3月齡SPF級(jí)雄性Wistar健康大鼠40只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)買于湖北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)合格證號(hào):SCXK(鄂)2004-0007]，在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)。飼養(yǎng)于清潔柜，普通飼料喂養(yǎng)，環(huán)境溫度21～25 ℃，濕度50%～60%。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后開(kāi)始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將40只大鼠隨機(jī)分為4組：空白組、模型組、標(biāo)本配穴組和西藥組，每組各10只?？瞻捉M：常規(guī)喂養(yǎng)，不做其他處理；其余各組大鼠以急性應(yīng)激與慢性應(yīng)激相結(jié)合CAS 方法制備IBS-D大鼠模型，參照文獻(xiàn)方法[8]：將大鼠暴露于7種不同的壓力源：①禁食24 h;②禁水24 h;③夾尾巴1 min;④45 ℃熱水5 min;⑤4 ℃冰水3 min;⑥晝夜倒置12 h;⑦水平振動(dòng)45 min。所有應(yīng)激方案每7 d隨機(jī)應(yīng)用，持續(xù)3周，其中連續(xù)2 d無(wú)重復(fù)特定的壓力源。在第28天，1周的休息之后是急性束縛應(yīng)激，包裹肩部、上肢前肢和胸廓1 h,提高了造模的成功率。造模過(guò)程中觀察大鼠糞便情況,對(duì)比空白組與其他大鼠稀便率評(píng)價(jià)模型建立效果。即將每組大鼠分開(kāi)放置于鐵籠中, 6 h內(nèi)分別記錄各組大鼠排出的稀便顆數(shù)與總的排便顆數(shù)，以稀便率(稀便數(shù)/總排便粒數(shù)×100%)判斷IBS-D模型是否復(fù)刻成功。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 空白組 飼喂普通飼料，每日作抓取訓(xùn)練，共21 d；模型組建立IBS-D模型，每日作抓取、鼠衣穿戴和懸掛訓(xùn)練，共21 d；標(biāo)本配穴組于造模同時(shí)進(jìn)行干預(yù)，參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[9]取穴，選取實(shí)驗(yàn)大鼠的雙側(cè)足三里、關(guān)元和內(nèi)關(guān)穴，用0.30 mm×13 mm華佗牌毫針直刺，針刺深度3～5 mm，并接G6805-Ⅱ型電針治療儀，連續(xù)波，頻率120 r/min，強(qiáng)度1 mA，以大鼠雙下肢輕微抖動(dòng)為宜，留針15 min，1次/d，共21 d。

1.4.2 西藥組 造模的同時(shí)，予以匹維溴銨混懸液灌胃，每日15 mg/kg，共21 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 一般體征及糞便含水量的觀察 觀察每組大鼠的精神狀態(tài)、體重、毛發(fā)色澤、飲食和活動(dòng)等情況，并在造模前、造模(治療)4周后2個(gè)時(shí)間點(diǎn)將大鼠置于代謝鼠籠，在下方墊放潔凈濾紙。收集3 h內(nèi)的大鼠糞便，計(jì)數(shù)并稱濕重，烘干后再次稱重，計(jì)算糞便含水量=[(濕重-干重)/濕重]×100%。

1.5.2 內(nèi)臟高敏感性評(píng)價(jià) 在檢測(cè)前將大鼠不禁水、禁食12 h,然后將其放在自制的固定器上,采用乙醚淺度麻醉，使大鼠失去抵抗力。先將2 mL注射器與血壓計(jì)相連，向血壓計(jì)中注氣，分別記下10、20、40、60和80 mmHg所對(duì)應(yīng)的刻度，然后將注射器與8F導(dǎo)尿管相連，由注射器向?qū)蚬苤凶猓⑷胫料鄳?yīng)的刻度，表示導(dǎo)尿管前端球囊內(nèi)的壓力達(dá)到相應(yīng)的壓強(qiáng)。將導(dǎo)尿管自肛門插入，待球囊末端伸入肛門約1 cm,將其固定防止脫出，待大鼠適應(yīng)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。向?qū)蚬軆?nèi)注氣，使球囊內(nèi)壓強(qiáng)分別為10、20、40、60和80 mmHg。每個(gè)壓強(qiáng)分別持續(xù)20 s，觀察大鼠在各個(gè)壓強(qiáng)下的反應(yīng)，對(duì)其進(jìn)行半定量評(píng)分。每個(gè)壓力下重復(fù)3次并評(píng)分，取其平均值并記錄[10]。

評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[11]，按照刺激大鼠時(shí)的表現(xiàn)評(píng)分:0分，無(wú)行為反應(yīng)；1分，僅頭部短暫運(yùn)動(dòng)，身體不動(dòng)；2分，腹部肌肉收縮，但未抬離底面；3分，腹肌收縮并抬離底面；4分，骨盆抬起，身體呈弓形。

1.5.3 大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP及D-乳酸檢測(cè) 內(nèi)臟高敏感性試驗(yàn)結(jié)束后,各組大鼠禁食不禁水24 h,麻醉后,從腹主動(dòng)脈中采集動(dòng)脈血5 mL,離心分離血清,4℃保存,ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸的含量。

1.5.4 采用透射電鏡觀察大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu) 分離大鼠腸的組織，用4%多聚甲醛和2%戊二醛將樣品進(jìn)行固定，脫水、包埋、切片和染色，觀察腸組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù),連續(xù)型變量采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述。若各組數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布且方差齊, 則采用單因素方差分析比較多組均數(shù)；若各組數(shù)據(jù)不全部呈正態(tài)分布, 則進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般體征和糞便含水量的觀察比較

空白組大鼠皮毛亮白順滑，行為活躍，精神佳，進(jìn)食量正常，大便正常；模型組大鼠皮毛枯燥變黃，精神不振，活動(dòng)減少，煩躁易怒，飲食減少，大便變軟呈稀狀，肛周常附著稀便；標(biāo)本配穴組及西藥組在干預(yù)后組間無(wú)顯著差異，精神較模型組更佳，皮毛稍顯枯燥且無(wú)明顯變黃，大便逐步恢復(fù)正常。

造模前各組糞便含水量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；除空白組外，其他組造模(治療)后較造模前糞便含水量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與空白組比較，其他組糞便含水量升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，標(biāo)本配穴組和西藥組糞便含水量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組比較，標(biāo)本配穴組糞便含水量降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組干預(yù)前后糞便含水量的變化

2.2 內(nèi)臟高敏感性比較

與空白組比較，其他3組大鼠在不同球囊壓力下的AWR評(píng)分有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，標(biāo)本配穴組及西藥組大鼠在不同壓力下的AWR評(píng)分有降低趨勢(shì)，各組AWR 評(píng)分差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組比較，標(biāo)本配穴組在不同壓力下的AWR評(píng)分顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組干預(yù)之后對(duì)IBS-D大鼠內(nèi)臟高敏感性的影響

2.3 大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量比較

與空白組相比，其他3組大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量有所升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，標(biāo)本配穴組及西藥組大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量有降低趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與西藥組比較，標(biāo)本配穴組大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 干預(yù)之后對(duì)IBS-D大鼠血清中TNF-α、INF-γ、SP和D-乳酸含量的影響

2.4 大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)(電鏡)

空白組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)正常，微絨毛排列緊密整齊未見(jiàn)脫落，長(zhǎng)度一致，緊密連接結(jié)構(gòu)正常，橋粒清晰可見(jiàn)；模型組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)損傷，微絨毛部分排列較稀疏，分布不均，緊密連接結(jié)構(gòu)破壞間隙增寬；標(biāo)本配穴組及西藥組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)較為正常，微絨毛排列較整齊，橋粒清晰可見(jiàn)，其中標(biāo)本配穴組微絨毛排列較西藥組整齊，緊密連接完整，較清晰，腸黏膜屏障損傷減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠腸黏膜超微結(jié)構(gòu)(電鏡,5 000×)

3 討論

IBS-D是一種臨床常見(jiàn)的由多因素共同作用的胃腸疾病，目前尚未有單一機(jī)制來(lái)闡明該病的發(fā)病機(jī)制，近年腸黏膜屏障在IBS發(fā)病中的作用備受關(guān)注[12]，并且腸道通透性增加也是內(nèi)臟高敏感性發(fā)生的關(guān)鍵因素[13]。緊密連接結(jié)構(gòu)(Tight junction，TJ)是腸粘膜屏障的重要構(gòu)成部分，是最重要的細(xì)胞連接，分布于腸黏膜細(xì)胞膜的邊緣與頂端處，對(duì)于細(xì)胞通透性和防止有害物質(zhì)入侵起關(guān)鍵作用，緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞則可導(dǎo)致腸道屏障功能受損、增加細(xì)胞通透性，使水和電解質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)紊亂從而產(chǎn)生腹瀉[14-15]。有研究表明，細(xì)胞因子如腸上皮屏障中γ干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)是影響緊密連接的重要因子，當(dāng)其表達(dá)上調(diào)時(shí)可損壞腸黏膜屏障,致使?jié)B透性異常[16]。其中TNF-α對(duì)腸上皮屏障的跨上皮電阻具有降低作用，INF-γ能下調(diào)緊密連接蛋白o(hù)ccludin、ZO-1的高表達(dá)，使腸上皮細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，還可造成腸道感覺(jué)和動(dòng)力異常[17]。P物質(zhì)(Substance p,SP)是一種感覺(jué)性的、可促炎性的神經(jīng)遞質(zhì)，SP表達(dá)增加會(huì)促使Th1細(xì)胞釋放IFN-γ與TNF-α，導(dǎo)致腸道粘膜遭到破壞，同時(shí)炎癥反應(yīng)會(huì)增加胃腸道的負(fù)擔(dān)，干擾胃腸道反射，應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)臟感覺(jué)系統(tǒng)敏銳化[18]。D-乳酸水平可以有效評(píng)價(jià)腸粘膜的通透性與腸道損傷情況，反應(yīng)腸道機(jī)械屏障的功能[19]。有研究表明，下調(diào)血漿中D-乳酸水平可以有效改善腸上皮緊密連接狀態(tài)，緩解腸易激綜合征癥狀[20]。

腸易激綜合征在中醫(yī)學(xué)中屬“泄瀉”“腹痛”的范疇，在《中國(guó)臨床診療術(shù)語(yǔ)》中明確IBS病名為“腸郁”，該病發(fā)病多以情志失調(diào)為誘因，導(dǎo)致氣機(jī)紊亂，腸腑傳導(dǎo)失司。治療以調(diào)神理氣、通導(dǎo)腸腑為治則，以調(diào)心神為基礎(chǔ)，達(dá)到標(biāo)本兼治的效果[21-22]?！端貑?wèn)·刺熱論》中記載：“病雖未發(fā)，見(jiàn)赤色者刺之，名曰治未病?！贬樉挠糜陬A(yù)防疾病稱為“逆針灸”,“逆針灸”一詞首見(jiàn)于明代高武《針灸聚英》曰:“無(wú)病而先針灸曰逆。逆，未至而迎之也”[23]。是中國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥治未病的主要手段之一，本實(shí)驗(yàn)在造模同時(shí)開(kāi)始予以針刺治療蘊(yùn)含著針灸“治未病”的思想理論。在“治未病”的指導(dǎo)思想下，采用標(biāo)本配穴法。關(guān)元穴與足三里穴為臨床常用的強(qiáng)壯保健要穴，關(guān)元穴為任脈腧穴，是小腸之募穴和足三陰與任脈的交會(huì)穴，是先天之根本，真元之根，為三焦之氣所生處，一身元?dú)庵?，可補(bǔ)充元?dú)?，增益精元，固護(hù)人體先天之本。足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴、胃之下合穴，具有和胃健脾、補(bǔ)中益氣、通調(diào)腑氣和扶正以固護(hù)后天之本的功能。兩穴配伍共奏固護(hù)元?dú)?、?qiáng)身健體之功效。內(nèi)關(guān)穴為八脈交會(huì)穴，與陰維脈相通，通過(guò)胃經(jīng)、脾經(jīng)和腎經(jīng)，陰維脈與沖脈在胃、心、胸部相合，調(diào)節(jié)情志失和、氣機(jī)阻滯相關(guān)病證，具有宣通三焦的功效，研究表明，針刺內(nèi)關(guān)穴可改善腹痛、腹瀉，減弱內(nèi)臟高敏反應(yīng)等整體癥狀[24-25]。三穴合用，共奏調(diào)理心神、通導(dǎo)腸腑以達(dá)從心論治和標(biāo)本兼顧的功效。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：IBS大鼠為腹瀉型，模型復(fù)刻成功。與空白組比較，模型組大鼠的腸上皮細(xì)胞緊密連接結(jié)構(gòu)遭到破壞，AWR評(píng)分、TNF-α、IFN-γ、SP和D-乳酸水平升高。經(jīng)過(guò)治療后，標(biāo)本配穴組與西藥組AWR評(píng)分和血清中TNF-α、IFN-γ、SP及D-乳酸含量下降，電鏡下腸粘膜上皮細(xì)胞形態(tài)較為正常，微絨毛排列較整齊，橋粒清晰，黏膜損傷、緊密連接結(jié)構(gòu)得到改善，且標(biāo)本配穴組比西藥組更接近于空白組水平。研究說(shuō)明，標(biāo)本配穴電針可改善細(xì)胞因子水平，保護(hù)腸道通透性，降低內(nèi)臟高敏感性，為臨床上治療腹瀉型腸易激綜合征提供新的配穴思路。