王春霞，谷栩萌，孫興華，武文鵬,2△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是癡呆最常見的原因，約占癡呆全部類型的60%～70%[1-2]。癡呆已成為全球老年人殘疾和依賴他人的最主要原因，是一個迅速加劇的公共衛(wèi)生問題，給患者家庭及其照料者、社會帶來沉重負(fù)擔(dān)[3-7]。目前，已被批準(zhǔn)上市的藥物只能減緩阿爾茨海默病的臨床癥狀，而無法完全治愈該疾病[8-10]。因此，探討阿爾茨海默病的相關(guān)致病機制及防治手段是近十年醫(yī)學(xué)界關(guān)注的重點和熱點。淀粉樣前體蛋白(Amyloid precursor protein，APP)是一種廣泛存在于多種組織細(xì)胞膜上的跨膜蛋白，通過降解可生產(chǎn)β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)，具有參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫反應(yīng)等多種功能[11-12]。β-淀粉樣前體蛋白(β-amyloid precursor protein，β-APP)的翻譯后修飾異常被認(rèn)為是影響APP代謝所致Aβ沉積病理過程的重要環(huán)節(jié)[13]。研究表明，針刺在阿爾茨海默病的防治中發(fā)揮著重要作用，并被廣泛應(yīng)用于臨床[14-17]。本研究觀察頭穴叢刺對阿爾茨海默病模型大鼠空間記憶及海馬區(qū)β-APP的表達(dá)影響，以期為針刺防治阿爾茨海默病提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Morris水迷宮(安徽淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)；大鼠腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)；徠卡RM2135型切片機(德國Leica)；Moticam3000顯微攝影成像系統(tǒng)(美國Motic公司)；超速冷凍離心機(型號：H-2050R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；熒光定量PCR儀(型號：Exicycler 96，韓國BIONEER公司)；LKB-V型超薄切片機(瑞士BROMMA公司)；Motic Med 6.0病理圖像分析系統(tǒng)(美國Motic)；淀粉樣β蛋白片段1-42(批號：MB3894，大連美倫生物技術(shù)有限公司)；β-APP ELISA試劑盒(貨號：TWp027502，上海通蔚生物公司)；兔抗多克隆一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔抗多克隆二抗PV6001(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；DAB顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；TRIpure(貨號：RP1001，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶(貨號：PR6502，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；RNase inhi-bitor(貨號：RP5602，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；2×Power Taq PCR MasterMix(貨號：PR1702，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)；SYBR Green(貨號：SY1020，北京百泰克生物技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗動物與分組

1.2.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠70只，雄性，3月齡，體質(zhì)量(220±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(黑)2016004。

1.2.2 動物分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后將過于遲鈍或反應(yīng)特別敏感的大鼠剔除，保留60只大鼠作為實驗用。按隨機原則，分出12只為正常組，再分出12只為假手術(shù)組，其余大鼠用于AD模型制備。取AD造模成功大鼠24只，按照隨機數(shù)字表法分為模型組和頭穴叢刺組，每組各12只。

1.3 AD模型制備

采用雙側(cè)海馬內(nèi)注射Aβ1-42誘導(dǎo)AD模型。采用1%戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，固定大鼠于腦立體定位儀上，常規(guī)備皮，切開皮膚，選取雙側(cè)海馬區(qū)作(前囟后3.0 mm，中線分別向左右旁開2.5 mm，硬膜下3 mm)為注射靶區(qū)，用牙科鉆將顱骨鉆開，應(yīng)用微量進(jìn)樣器將Aβ1-42溶液2.5 μg/μL緩慢注入，5 min內(nèi)注射完，留針5 min。撤針后，牙科泥封住顱骨孔，將慶大霉素滴于術(shù)區(qū)，常規(guī)縫合皮膚并消毒。假手術(shù)組除用等量生理鹽水代替Aβ1-42溶液外，其余同模型組。

1.4 干預(yù)方法

1.4.1 頭穴叢刺組 造模成功后第7天開始，參照《實驗針灸學(xué)》[18]取穴，取百會穴及百會穴左側(cè)旁開1 mm處、百會穴右側(cè)旁開1 mm，用0.35 mm×15 mm毫針針刺，針刺深度約2 mm，每穴平補平瀉快速捻轉(zhuǎn)1 min，留針30 min，1次/d，連續(xù)干預(yù)14 d。

1.4.2 正常組 不給予任何處理，正常飼養(yǎng)。

1.4.3 假手術(shù)組、模型組 同時段抓取、捆綁固定30 min，不進(jìn)行其他處理。

1.5 檢測指標(biāo)

1.5.1 Morris水迷宮行為學(xué)測試 分別于造模后且干預(yù)前、針刺干預(yù)后采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠空間學(xué)習(xí)、記憶能力。各組每次檢測前先進(jìn)行連續(xù)4 d的訓(xùn)練，每只大鼠訓(xùn)練2 min，每天4次，每次間隔30 min。在訓(xùn)練過程中，每次尋找平臺的上限時間限定為2 min。大鼠找到平臺，并爬上平臺，則讓大鼠在平臺上停留20 s；若在上限時間內(nèi)未能找到平臺或未爬上平臺，則將大鼠引導(dǎo)至平臺上，并停留20 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d后的次日記錄各組大鼠下水后找到平臺的時間，即潛伏期；而后，去除水中平臺，記錄大鼠1 min內(nèi)穿越平臺次數(shù)。

1.5.2 大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá) 采用免疫組化法，于治療14 d后，每組取6只大鼠腹腔注射10%水合氯醛(300 mg/kg)麻醉后斷頭取腦組織，在冰臺上剝離雙側(cè)海馬組織，將海馬組織放入4%多聚甲醛固定液中固定，組織經(jīng)修塊后，經(jīng)酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋成塊，制備石蠟切片。切片常規(guī)脫蠟到水，按照免疫組化試劑盒說明書進(jìn)行具體步驟操作，Motic3000顯微攝影系統(tǒng)下，每組隨機選取6張切片，每張切片隨機分析3個高倍鏡視野，拍照并選取視野內(nèi)所有陽性顆粒，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對陽性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以陽性細(xì)胞數(shù)代表蛋白相對表達(dá)量。染色結(jié)果細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽性為黃色或黃棕色。

1.5.3 大鼠海馬區(qū)β-APP mRNA表達(dá) 采用實時熒光定量PCR法，采用TRIpure試劑盒(BioTeke公司)提取總RNA，紫外分光光度計測RNA濃度，按照Super M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(BioTeke公司)說明書的操作步驟將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用熒光定量PCR儀(BIONEER公司)并按照SYBR Green試劑盒(Solarbio公司)的要求，以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測β-APP蛋白mRNA相對表達(dá)量。引物設(shè)計由生工生物工程(上海)有限公司根據(jù)Real-time PCR引物設(shè)計原則合成。引物序列：β-APP基因：F：GCGGTGAAGACAAAGTCG；R：TCAAAGTACCAGCGGGAG；擴增長度271 bp；β-actin基因：F：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC；R：ATGGAGCCACCGATCCACA；擴增長度171 bp。根據(jù)RealTimePCR原始檢測結(jié)果，按照2-△△ct相對定量計算公式計算出各樣品的目的基因相對定量結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)比較

治療前與干預(yù)14 d后，與正常組比較，假手術(shù)組大鼠潛伏期和穿臺次數(shù)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療前和干預(yù)14 d后，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠潛伏期均顯著延長(P<0.01)，穿臺次數(shù)均顯著減少(P<0.01)。干預(yù)14 d后，與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠潛伏期明顯縮短(P<0.01)，穿臺次數(shù)明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠治療前后定位航行試驗逃避潛伏期、穿臺次數(shù)比較

2.2 各組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)比較

與正常組比較，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)量明顯降低(P<0.01)。見表2、圖1。

表2 各組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)比較

注：a.正常組；b.假手術(shù)組；c.模型組；d.頭穴叢刺組。圖1 各組大鼠海馬組織HE染色圖(400×)

2.3 各組大鼠海馬區(qū)β-APP mRNA表達(dá)比較

與正常組比較，假手術(shù)組大鼠海馬區(qū)β-APP基因的mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬區(qū)β-APP基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠海馬區(qū)β-APP基因的mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。見表3、圖2。

表3 各組大鼠海馬區(qū)β-APP mRNA表達(dá)比較

圖2 β-APP基因?qū)崟r擴增曲線圖及產(chǎn)物溶解曲線圖

3 討論

阿爾茨海默病(AD)屬于中醫(yī)學(xué)“癡呆”范疇。中醫(yī)學(xué)對本病的認(rèn)識較早，如《景岳全書·雜病謨》曰：“癡呆證，凡平素?zé)o痰，而或以郁結(jié)，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐，而漸至癡呆，言辭顛倒，舉動不經(jīng)……其證則千奇萬怪，無所不至。”又如《醫(yī)林改錯·腦髓篇》所載：“高年無記性者，腦髓漸空?！敝嗅t(yī)學(xué)認(rèn)為，本病的形成以內(nèi)因為主，多由于年邁體虛、七情內(nèi)傷、久病耗損等原因?qū)е職庋蛔?、腎精虧耗和腦髓失養(yǎng)，或氣滯、痰阻、血瘀于腦，神明失用而成。本病的病位在腦。腦為髓海，元神之府，神機之用。因此，課題組將頭穴叢刺用于阿爾茨海默病患者的臨床治療，并發(fā)現(xiàn)頭穴叢刺能夠延緩AD的進(jìn)展，改善患者的認(rèn)知功能，提高患者的生活質(zhì)量。頭穴叢刺針法是以中醫(yī)學(xué)經(jīng)絡(luò)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)神經(jīng)解剖理論為基礎(chǔ)建立起來的以在頭部相應(yīng)治療區(qū)進(jìn)行“叢式”的針刺治療疾病的一種方法，被廣泛應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床治療。

阿爾茨海默病以起病隱襲、呈進(jìn)行性發(fā)展、記憶力和認(rèn)知功能衰退以及人格改變?yōu)榕R床主要特征，其中記憶障礙是阿爾茨海默病典型的首發(fā)征象[19-22]。海馬區(qū)是人腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，主要有長時記憶的存儲轉(zhuǎn)換和定向等功能，是大腦參與學(xué)習(xí)記憶過程的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。因此，本實驗以海馬區(qū)作為觀察研究的對象。學(xué)習(xí)記憶的評價是阿爾茨海默病動物模型的必要檢測指標(biāo)之一。Morris水迷宮以其能夠提供較為豐富的實驗參數(shù)，能夠系統(tǒng)的反映實驗動物的學(xué)習(xí)記憶水平而被廣泛應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機制等領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中[23-25]。同時，Morris水迷宮還具有操作簡便、數(shù)據(jù)誤差較小的特點。本實驗結(jié)果表明，干預(yù)14 d后，與模型組比較，頭穴叢刺組大鼠潛伏期明顯縮短，穿臺次數(shù)明顯增加，說明頭穴叢刺能夠改善AD模型大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力。

阿爾茨海默病的主要特征性病理改變表現(xiàn)為老年斑、神經(jīng)元纖維纏結(jié)、海馬錐體細(xì)胞顆?？张葑冃院蜕窠?jīng)元缺失[26-28]。其病因與發(fā)病機制至今尚未完全闡明，目前有多種學(xué)說[29-31]。有研究表明，細(xì)胞外聚集的β-淀粉樣蛋白在腦內(nèi)沉積形成老年斑，進(jìn)一步激化小膠質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，誘發(fā)氧化應(yīng)激損害，使細(xì)胞凋亡途徑被激活，促進(jìn)Tau蛋白異常磷酸化[32]。β-淀粉樣蛋白是一種疏水性強且易聚集的多肽蛋白，已知其主要成分有Aβ1-40和Aβ1-42。研究發(fā)現(xiàn)，β-淀粉樣蛋白在腦組織的沉積與異常代謝與神經(jīng)元損傷、記憶障礙等密切相關(guān)，是阿爾茨海默病發(fā)病的重要環(huán)節(jié)[33-34]。因此，本實驗采用海馬區(qū)雙側(cè)注射Aβ制備大鼠阿爾茨海默病模型，該方法能夠快速構(gòu)建阿爾茨海默病急性損傷模型，動物會隨之出現(xiàn)與阿爾茨海默病患者相似的記憶功能障礙。本實驗結(jié)果表明，治療前，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠潛伏期顯著延長，穿臺次數(shù)顯著減少，說明模型組出現(xiàn)學(xué)習(xí)能力下降，表明本實驗造模成功。

β-淀粉樣蛋白為β-淀粉樣前體蛋白(APP)的水解產(chǎn)物，是老年斑的核心，其α、β、γ分泌酶參與其合成代謝。APP普遍存在于腦脊液、血液中，可在人體多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)。生理狀態(tài)下，APP發(fā)揮著保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用，能夠促進(jìn)神經(jīng)營養(yǎng)活性及神經(jīng)生長，與學(xué)習(xí)、記憶功能相關(guān)[35]。在病理狀態(tài)下，當(dāng)APP過表達(dá)，則會導(dǎo)致具有細(xì)胞毒性作用的β-淀粉樣蛋白沉積。另有研究表明，當(dāng)β分泌酶將APP切割成β-淀粉樣蛋白而聚合形成不溶性高分子聚合物，進(jìn)而參與老年斑的形成[36]。本實驗觀察到，模型組大鼠海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，表明β-APP參與AD大鼠模型的病理過程；頭穴叢刺能明顯下調(diào)β-APP蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)水平。

綜上所述，運用頭穴叢刺針刺法能有效改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，其機制可能與調(diào)控海馬區(qū)β-APP蛋白表達(dá)有關(guān)。