方丹丹 張婷 文曉鵬

（1. 貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院 生命科學(xué)學(xué)院 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室 貴陽 550025；2. 貴陽學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院 貴州省山地珍稀動物與經(jīng)濟(jì)昆蟲重點實驗室，貴陽 550005）

磷元素是植物生長發(fā)育過程中不可或缺的營養(yǎng)元素之一，是促進(jìn)植物生長發(fā)育的重要元素，但土壤對磷元素有著強烈的吸附作用。土壤溶液中的無機磷酸鹽作為植物磷的主要來源，大多是以沉淀的形式存在于土壤環(huán)境中；同時可以與土壤溶液中的陽離子形成絡(luò)合物，導(dǎo)致土壤環(huán)境中的有機磷不能直接被植物吸收利用［1］。植株在低磷脅迫環(huán)境中會通過根系向土壤中排放其分泌物，進(jìn)而活化土壤中的無機、有機磷，以及接收缺磷的信號來誘導(dǎo)表達(dá)磷轉(zhuǎn)運蛋白基因［2-4］。多項研究表明，植物在響應(yīng)低磷脅迫的過程中，磷轉(zhuǎn)運蛋白（Phosphorus Transporter，PT）會被高效誘導(dǎo)表達(dá)，而正常供磷環(huán)境下該蛋白反被抑制［5-9］。在低磷脅迫條件下，蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）PT1家族中的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因MtPT5和MtPT6下可以促進(jìn)有效磷向根瘤運輸，使根瘤中保持磷平衡［10］。Xu等［11］從玉米（Zea Mays）中分離出ZmPt9，過表達(dá)擬南芥后發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因擬南芥具有小葉子和早開花的現(xiàn)象。Naureen等［12］借助VIGS介導(dǎo)的基因瞬時沉默的技術(shù)方法，對番茄（Solanum lycopersicum）中的SlPT1基因的沉默導(dǎo)致番茄植株在低磷脅迫的條件下保護(hù)酶類活性顯著下降。在磷素吸收與轉(zhuǎn)運分配過程中，對杉木（Cunninghamia lanceolata）中的磷酸轉(zhuǎn)運蛋白PHT1家族中的ClPht1基因進(jìn)行同源轉(zhuǎn)化發(fā)現(xiàn)，該基因參與杉木地下部分和地上部分磷素的運輸和分配［13］。雙子葉植物紫云英（Astragalus sinicus）中磷轉(zhuǎn)運蛋白AsPT5基因?qū)υ鰪娖渲仓瓯旧砀祵α姿猁}的吸收起著關(guān)鍵性的作用［14］。由此可知，磷轉(zhuǎn)運蛋白（PHT）在植物吸收磷酸鹽中具有重要作用。然而，木本植物中的PHT家族基因在其他植物中賦予植物生長的作用還有待探索。馬尾松（Pinus massoniana）是我國松屬類分布最廣的針葉樹種，是擁有多方面用途的用材林，同時支撐著我國森林文化、醫(yī)療保健和化工業(yè)等多個行業(yè)，被冠名為“高附加值林產(chǎn)品的經(jīng)濟(jì)樹種”［15］。在我國部分缺磷嚴(yán)重的地區(qū)，馬尾松經(jīng)歷長期的地理隔離、生殖隔離和自然選擇，致使其種內(nèi)產(chǎn)生遺傳變異現(xiàn)象，在低磷環(huán)境下展現(xiàn)出良好的適應(yīng)生存能力。前期研究發(fā)現(xiàn)通過對馬尾松在低磷脅迫下的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的效應(yīng)，其中磷轉(zhuǎn)運蛋白基因在低磷脅迫環(huán)境下具有良好的作用機制［5］。因此，進(jìn)行相關(guān)植株遺傳轉(zhuǎn)化可以分析其潛在的應(yīng)用價值。本研究通過采用花序浸染法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，探討在低磷脅迫條件下馬尾松高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白PmPT3基因在草本植物擬南芥中耐低磷脅迫的能力，可為林木優(yōu)良基因的利用及創(chuàng)制耐低磷新種質(zhì)提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

生態(tài)型哥倫比亞擬南芥（Arabidopsis thaliana）種子，馬尾松PmPT3基因（GenBank注冊號為KT390744）由本實驗前期克隆并注冊，農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌株、植物表達(dá)載體pBWA（V）HS由貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存。

1.2 方法

1.2.1 PmPT3基因擴(kuò)增及純化 根據(jù)馬尾松PmPT3基因序列與pBWA（V）HS質(zhì)粒上原有的限制性內(nèi)切酶酶切位點，利用軟件Primer5設(shè)計特異性正反引物，并在引物5′端插入Ase I和Bsa I的酶切位點及保護(hù)堿基，所獲得的克隆正反引物序列見表1，用該引物對馬尾松cDNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)總體系為 10 μL，包括 PreMix 5 μL，正反引物各 0.5 μL，模板 1 μL，ddH2O 3 μL。PCR 反應(yīng)程序 ：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s；50℃退火45 s；72℃延伸90 s；30個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，回收純化，保存在-20℃冰箱中備用。

1.2.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化 將回收產(chǎn)物連接到BLUNT載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α 37℃培養(yǎng)過夜，篩選陽性菌落進(jìn)行測序，提取質(zhì)粒備用。分別用限制性內(nèi)切酶Ase I和Bsa I對含有PmPT3基因和pBWA（V）HS載體質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收PmPT3和pBWA（V）HS兩個目的片段。用T4連接酶將目的片段產(chǎn)物進(jìn)行過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α細(xì)胞，PCR鑒定陽性克隆，獲得重組質(zhì)粒后命名為pBWA（V）HSPmPT3。用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行陽性檢測。

1.2.3 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及陽性植株鑒定 將攜帶pBWA（V）HS-PmPT3超表達(dá)載體的農(nóng)桿菌于液體培養(yǎng)基中活化過夜培養(yǎng)，用15%蔗糖溶液懸浮離心2次后將農(nóng)桿菌重懸于20 mL滲透液（15%蔗糖+20 μL Silwet-77，OD600=1.0-1.2）中，將提前澆足水的擬南芥上的果莢和完全開放的花剪除，將滲透液充分搖勻后浸泡擬南芥花絮1 min，幼嫩的枝條花絮浸染30 s，同時輕微震蕩。浸染后暗培養(yǎng)36 h，然后置于正常培養(yǎng)1周左右方可澆水，并定期繼續(xù)浸染2-3次，培養(yǎng)至種子成熟備用。將收集到的種子培養(yǎng)于MS+20 mg/L Hyg（潮霉素B）+100 mg/L Cep（頭孢）的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，pH=5.8，篩選得到T0代植株后，分株收獲T1代轉(zhuǎn)基因種子。按照上步方法篩選T1代轉(zhuǎn)基因種子，根據(jù)孟德爾遺傳定律挑選符合3∶1分離比的T2代苗，分株收獲T2代轉(zhuǎn)基因種子，經(jīng)篩選培養(yǎng)最終得到T3代轉(zhuǎn)基因種子，培養(yǎng)T3代轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 低磷脅迫處理及相關(guān)生理生化指標(biāo)的測定 將擬南芥野生型和篩選得到的T3代轉(zhuǎn)基因種子分別在MS條件下春化處理4 d，繼續(xù)培養(yǎng)5 d，挑選長勢一致的擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株，分別移植到低磷（LP，0.125 mmol/L）、對照（MS，1.25 mmol/L）2個供磷水平的培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 d后，觀察葉片、根系的形態(tài)變化，測定相關(guān)生理生化指標(biāo)：地上和地下部分的干重，總磷和無機磷含量，丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性（測量方法參照購于索萊寶生物科技有限公司的試劑盒）。每項生理生化指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥PmPT3基因表達(dá)分析 提取轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分和根部的RNA，并進(jìn)行cDNA第一鏈合成。之后進(jìn)行PmPT3基因的qRT-PCR表達(dá)分析，Actin2為內(nèi)參基因［9］，所用引物名稱及基因特異性引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)體系為10 μL ：SYBR? Green Master Mix 5.0 μL、ddH2O 4.0 μL、正反向引物各0.25 μL、模板cDNA 0.5 μL。擴(kuò)增程序 ：95℃ 10 min；95℃ 15 s；59℃ 30 s；72℃ 60 s；40個循環(huán)。

表1 實驗所用引物及序列Table 1 Primers and sequences used in the study

2 結(jié)果

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

cDNA模板PCR擴(kuò)增后進(jìn)行回收（圖1-A），將目的基因條帶連接BLUNT載體，測序拼接結(jié)果與PmPT3基因的ORF一致。進(jìn)行雙酶切后，酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測（圖1-B，圖1-C），獲得大小兩個條帶，小條帶的大小在1 700 bp-1 800 bp之間，目的基因序列大小處于該區(qū)間內(nèi)。轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α細(xì)胞，獲得重組質(zhì)粒pBWA（V）HS-PmPT3，條帶大小符合（圖1-D）。向農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞加入重組質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)化后，菌落PCR及凝膠電泳檢測（圖1-E），經(jīng)過比對與目的基因條帶相符，進(jìn)而說明農(nóng)桿菌中已成功轉(zhuǎn)入pBWA（V）HSPmPT3質(zhì)粒，植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖1 馬尾松PmPT3基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建Fig.1 Construction of plant expression vector of P. massoniana PmPT3 Gene

2.2 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得及表達(dá)分析

采用花序浸染法，遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥（圖2），共獲得T1代擬南芥抗性植株27株，分別提取這27株擬南芥的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PmPT3基因的qRT-PCR表達(dá)分析，分析結(jié)果顯示27株株系中11號表達(dá)量最高，5號次之（圖3-A）。通過繼續(xù)篩選共獲得4株T3代純合株系，其馬尾松PmPT3基因表達(dá)量最高（圖3-B），進(jìn)行磷處理后，葉片、根系的形態(tài)變化如圖2-G和圖2-F。

圖2 馬尾松PmPT3遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥過程Fig.2 Process of genetic transformation of P. massoniana PmPT3 into Arabidopsis

圖3 T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥qRT-PCR分析（A）及純合株系PCR檢測（B）Fig.3 Analysis of positive gene expression in T1 generation transgenic Arabidopsis thaliana (A) and PCR detection of homozygous strains (B)

2.3 低磷脅迫對酶活性與丙二醛含量的影響

在正常供磷條件下，擬南芥野生型和轉(zhuǎn)基因植株過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化氫酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量差異不顯著，在低磷條件下轉(zhuǎn)基因植株的POD、SOD、CAT酶活性均高于野生型植株，分別是野生型植株的2.17倍（圖4-A）、1.59倍（圖4-B）、1.81倍（圖4-C）；MDA含量都增加，但野生型植株MDA含量極顯著高于轉(zhuǎn)基因植株，是轉(zhuǎn)基因植株的2.10倍（P＜0.05，圖4-D）。分析結(jié)果表明，在低磷脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因擬南芥中馬尾松PmPT3基因的超表達(dá)有效的增強了植株保護(hù)酶活性，降低了丙二醛含量，進(jìn)而增強了擬南芥耐低磷脅迫的能力。

圖4 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥POD（A）、SOD（B）、CAT（C）活性及MDA（D）含量的影響Fig.4 Effect of low phosphorus stress on the POD(A), SOD(B), CAT(C) activity and MDA(D) content of transgenic Arabidopsis

2.4 低磷脅迫對磷含量的影響

在正常供磷條件下，地上部分及根部總磷含量和無機磷含量無顯著性差異。低磷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分和根部總磷含量較野生型相比，分別提高了1.26倍和1.74倍（圖5-A），無機磷含量較野生型相比分別提高了1.38倍和1.89倍（圖5-B）。表明在低磷脅迫條件下PmPT3基因的超表達(dá)對擬南芥磷素吸收利用的能力有提高作用。

圖5 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥總磷含量（A）和無機磷含量（B）的影響Fig.5 Effect of low phosphorus stress on the total phosphorus content (A) and inorganic phosphorus content (B) of transgenic Arabidopsis

2.5 低磷脅迫對生物量的影響

在正常供磷條件下，地上部干重、根干重和總干重都無顯著差異，但在低磷脅迫條件下都表現(xiàn)出極顯著的差異，其中轉(zhuǎn)基因植株較野生型地上部干重增加了45.46%，根干重增加了55.56%，總干重增加了46.15%（圖6）。根冠比都大于正常供磷條件下的擬南芥，表明低磷脅迫對植株地下部分的抑制作用可能小于地上部分。

圖6 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部干重（A）、根干重（B）、總干重（C）和根冠比（D）的影響Fig.6 Effect of low phosphorus stress on the above-ground dry weight (A), root dry weight (B), total dry weight (C) and root to shoot ratio (D) of transgenic Arabidopsis

2.6 低磷脅迫對轉(zhuǎn)基因擬南芥PmPT3基因表達(dá)量的影響

無論是正常供磷條件下，還是低磷脅迫條件下，根部及地上部分PmPT3基因表達(dá)量都表現(xiàn)為極顯著性差異（圖7）。與正常供磷相比，低磷脅迫下PmPT3基因相對表達(dá)量在根部及地上部分的相對表達(dá)量顯著提高，且在根部相對表達(dá)量最高，這說明該基因主要在植株的根部發(fā)揮作用。

圖7 磷處理后馬尾松PmPT3基因相對表達(dá)量Fig.7 Relative expression of PmPT3 gene of P. massoniana after phosphorus treatment

3 討論

磷是植物生長發(fā)育所需的重要常量元素，根系從土壤中吸收磷是植物獲取磷的主要途徑。當(dāng)植物在面對低磷脅迫的過程中，植株本身不僅在發(fā)育、形態(tài)、生理和生化等方面形成復(fù)雜的機制來應(yīng)對低磷脅迫，同時在植物基因水平也發(fā)揮著不同的作用，以此來適應(yīng)各種逆境和脅迫帶來的不良影響［16］。當(dāng)植物生長在低磷脅迫環(huán)境中時，植物體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因?qū)l(fā)揮作用，其中PHT1基因家族是調(diào)節(jié)磷轉(zhuǎn)運非常重要的高親和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因，是植株細(xì)胞膜進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)運土壤中無機磷的重要轉(zhuǎn)運蛋白［17］。

本研究中，進(jìn)行低磷脅迫處理后，轉(zhuǎn)基因擬南芥的地上部分和根部總磷含量及無機磷含量都顯著提高，說明PmPT3基因的超表達(dá)可能增加了擬南芥對磷的吸收。對其他植物中同類基因的研究也有報道，例如，番茄植株在供磷水平低的條件下，SlPT1基因如果保持沉默，則會導(dǎo)致植株磷含量顯著降低［18］。在橡膠樹中，HbPHT1基因表達(dá)量的增加改善了植株磷的吸收、轉(zhuǎn)運和利用［19］。有研究發(fā)現(xiàn)白羽扇豆中的LaPT1基因，在低磷脅迫環(huán)境中，獲得高效表達(dá)，特別是在根中［20］。馬鈴薯進(jìn)行低磷處理后，磷轉(zhuǎn)運蛋白StPHT1基因獲得了過表達(dá)，根部的表達(dá)量高于莖和葉，這說明在低磷環(huán)境下，根部中StPHT1的依賴性可能大于莖與葉［21］。本研究中，低磷脅迫下PmPT3基因相對表達(dá)量在根部及地上部分的相對表達(dá)量顯著提高，且在根部相對表達(dá)量最高，與其他物種中的情況相似。

另外有研究表明，在植株處于非生物脅迫條件下，細(xì)胞會產(chǎn)生一系列活性氧簇來打破細(xì)胞內(nèi)自由基平衡，提高細(xì)胞膜透性，作為植物細(xì)胞抵御逆境的保護(hù)性酶類POD、SOD、CAT會明顯上升，以此來消除植物細(xì)胞內(nèi)多余的活性氧，進(jìn)而來減弱低磷脅迫對植物細(xì)胞膜系統(tǒng)、蛋白質(zhì)和核酸造成的損傷，達(dá)到保護(hù)植物的作用［22-24］。清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶SOD、POD和CAT，以及MDA的含量都能間接地反映細(xì)胞膜脂的過氧化程度，可反映植物耐逆境的能力［25］。在本研究中，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在低磷脅迫下SOD、POD、CAT活性較野生型顯著升高，MDA含量顯著降低。有研究表明，將馬鈴薯磷酸轉(zhuǎn)運蛋白StPht1-1基因過表達(dá)楊樹P39后生物量獲得顯著增加［26］。本研究中，擬南芥生物量的變化表明，PmPT3基因的超表達(dá)提高了擬南芥生物量的積累，與馬尾松Pht1家族中的基因在煙草中的結(jié)果相似［5］。

4 結(jié)論

馬尾松PmPT3基因的超表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥保護(hù)酶活性，降低了丙二醛含量，增加了磷含量和生物量的積累，進(jìn)而顯著提高了擬南芥耐低磷脅迫的能力。