武歡 盧珍紅 郝向陽 王斌 焦元辰 楊春梅 程春振，4

（1. 福建農(nóng)林大學園藝學院，福州 350002；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所，昆明 650100；3. 玉溪云星生物科技有限公司，玉溪 652604；4. 山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，太谷 030801）

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是生物防御系統(tǒng)的關鍵酶，可高效清除生物體內(nèi)超氧化物陰離子、過氧化氫和羥基自由基等物質(zhì)［1-2］。它還可以通過誘導其他一些抗氧化酶的活性，在有機體維持自由基動態(tài)平衡過程中發(fā)揮重要作用［3］。所有SOD的催化中心都含一個金屬離子，根據(jù)金屬輔基的差異，SOD家族可分為Cu/ZnSOD、FeSOD、MnSOD和NiSOD等4類［4］。其中，Cu/ZnSOD在植物中分布最廣、穩(wěn)定性最高，可提高植物的耐鹽性［5］。FeSOD僅存在于葉綠體中，熱穩(wěn)定性高［6］，參與調(diào)控植物的抗寒性及抗氧化能力［7-8］。與前兩種SOD不同，MnSOD主要是誘導型表達［9］，廣泛參與植物的抗逆防御，與旱生植物耐旱、耐鹽能力密切相關［10］。此外，MnSOD和FeSOD具有很高的相似性，可能起源于共同的祖先基因［11］。與FeSOD類似，MnSOD對植物抗寒性的也有促進作用［12］。而Ni-SOD是最近從土壤微生物和藍細菌分離獲得的一種SOD，與其他SOD相似性較低［4，13］，目前在植物中尚未見報道。

鑒于SOD在植物抗逆防護反應中的重要作用，人們對編碼SOD的基因展開了大量研究［14］。自1982年科學家從玉米中克隆獲得了SOD基因后［15］，眾多單子葉和雙子葉植物SOD基因被陸續(xù)克隆獲得［16］。多項研究顯示：提高SOD基因的表達可賦予植物抵抗多種非生物脅迫的能力。如過表達南瓜SOD的擬南芥，其冷誘導基因和干旱響應轉錄因子的表達顯著升高，抗低溫和干旱能力得到明顯增強［17］。過表達花生Cu/ZnSOD的煙草對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性顯著提升［11］。還有研究指出過表達MnSOD 可提高煙草［18］、小麥［19］和紫桿檉柳［20］等植物的抗鹽性。

非洲菊（Gerbera jamesonii）作為世界五大鮮切花之一，具有極高的商業(yè)價值［21］。目前有關非洲菊SOD基因的研究較少。在本研究中，我們從實驗室前期獲得的非洲菊轉錄組中篩選獲得一個包含完整ORF的SOD基因序列，使用反轉錄PCR克隆獲得該基因并對其進行了系列生物信息學分析，同時還研究了該基因在IAA、SA和GA3等激素處理和鹽、干旱和低溫等非生物脅迫處理下的表達模式，以期為揭示該基因的功能及其在非洲菊抗逆育種中的應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用非洲菊品種‘玲瓏’由云南省農(nóng)業(yè)科學院花卉研究所提供。選取生長狀態(tài)良好、長勢一致、株高約為30 cm的植株，取根、葉柄和葉片用于 RNA 提?。?2］。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 IAA、GA3和SA等3種激素（濃度均為 100 μmol/L）和鹽脅迫（200 μmol/L NaCl）處理參照孫雪麗等［23］的方法，于處理0 h、2 h、4 h、8 h、24 h和48 h取葉片。干旱脅迫（30% PEG-3000）處理參照郝向陽等［24］的方法，由于PEG模擬干旱處理植株顯癥時間較早，因此選擇于處理后0 h、1 h、2 h、4 h和6 h取葉片。4℃低溫處理參照王星淇等［25］的方法，于處理后0 h、4 h、8 h、12 h和24 h取葉片。所有樣品取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 利用Trizol RNA提取試劑盒（TaKaRa）提取非洲菊葉片總RNA。采用RevertAid第一輪cDNA 合成試劑盒（thermo scientific）合成cDNA第一鏈，用于基因全長克隆。同時采用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（One-Step gDNA Removel）試劑盒（全式金）逆轉錄合成不同處理樣品的cDNA用于qRT-PCR試驗。

1.2.3 SOD基因克隆及測序驗證 根據(jù)本實驗室前期獲得的非洲菊轉錄組數(shù)據(jù)，設計基因特異性引物（上游引物序列為：ATGGCTCTTCGAACCCTAG，下游引物序列為 ：TTAAGGGCACTCTTTCTC）。25 μL PCR 反應體系包括：Dream TaqTMGreen PCR Master Mix（2X）12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，cDNA 1 μL 和上下游引物各1 μL。PCR 擴增程序為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，45個循環(huán)；72℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。采用Gel/PCR Extraction Kit回收目的片段，連接到PMD 18-T載體后轉化DH5α感受態(tài)，經(jīng)菌液PCR鑒定后選取陽性克隆送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序驗證。

1.2.4 生物信息學分析 參照郝向陽等［24］的方法，利用在線軟件分析GjMnSOD蛋白基本理化性質(zhì)、亞細胞定位、信號肽、跨膜結構、磷酸化位點、蛋白二級結構以及保守結構域。分別使用在線工具分析前導肽（https：//ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html）、蛋白保守基序（http：//meme-suite.org/）和三維結構（https：//swissmodel.expasy.org/）。從 NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索并下載其他物種MnSODs的氨基酸序列，使用MEGE-X鄰近歸并法（neighbor-joining method）構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 SOD基因表達分析 以稀釋50倍的cDNA為模板，以非洲菊18S rRNA為內(nèi)參基因，在Roche Lighcycler 480熒光定量PCR儀上進行定量分析。qRT-PCR擴增程序為：95℃預變性30 s；95℃變性10 s；58℃退火30 s；72℃延伸30 s，共45個循環(huán)。qRT-PCR反應體系包含SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa）熒光染料 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上下游引物各 1 μL 和 cDNA 1 μL［24］。使用 2-△△CT法計算其不同處理下GjMnSOD相對表達量［26］。利用SPSS軟件分析不同樣品和處理間的差異顯著性，使用Excel 2016作圖。

2 結果

2.1 SOD基因克隆驗證及序列分析結果

成功從非洲菊品種‘玲瓏’中克隆獲得了一條789 bp的基因序列（圖1）。序列分析結果顯示，該基因的CDS長度為519 bp，預測可編碼172個氨基酸。BLASTn序列比對結果顯示該基因與其他物種MnSOD同源性較高。其中，與刺苞菜薊MnSOD基因序列同源性高達91.27%，與紫花苜蓿MnSOD基因序列同源性達90.45%，推測該基因是一個MnSOD基因（命名為：GjMnSOD，GenBank登錄號為 MH708534.1）。

圖1 cDNA擴增產(chǎn)物電泳檢測結果Fig. 1 Electrophoresis detection result of cDNA amplification products

2.2 GjMnSOD基因編碼蛋白理化性質(zhì)分析

分析結果顯示：GjMnSOD的編碼蛋白為穩(wěn)定的親水蛋白，分子量為19 203.85，分子式為C862H1346N238O252S4，原子總數(shù)為2 702，不穩(wěn)定系數(shù)23.52，脂肪系數(shù)為82.79，等電點7.93；該蛋白由19種氨基酸組成，其中亮氨酸（Leu）和賴氨酸（Lys）含量最多，均占9.3%；其次為丙氨酸（Ala），占8.1%。含有帶正電荷殘基總數(shù)（Ary+Lys）20個和帶負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）19個。磷酸化位點預測顯示，該蛋白中僅有4個磷酸化位點：酪氨酸（17thaa、19thaa），蘇氨酸（7thaa）和絲氨酸（18thaa）（圖2-A）。

GjMnSOD無跨膜結構、信號肽及線粒體前導肽結構，推測屬于非分泌性蛋白。通過分析其保守結構域，發(fā)現(xiàn)該蛋白含有SodA（位于1-164 aa間）和Sod-Fe-C（位于70-164 aa間）保守結構域和非特異性保守結構域PLN02471（位于1-160 aa間，圖2-B），屬于MnSOD家族。亞細胞定位預測結果顯示GjMnSOD主要定位于線粒體，與前人報道的植物MnSODs主要定位于線粒體或過氧化物酶體的結論相符。

圖2 GjMnSOD蛋白磷酸化位點及保守結構域預測結果Fig.2 Prediction of GjMnSOD protein phosphorylation site and conserved domain

2.3 保守基序預測及蛋白結構分析結果

GjMnSOD二級結構由44.19% 的α螺旋、30.18% 的無規(guī)則卷曲、8.14% 的β-轉角和16.86%的延伸片段構成（圖3）。MEME預測結果顯示，GjMnSOD包含11個保守基序（表1）。以擬南芥中錳超氧化物歧化酶的晶體結構（與GjMnSOD相似度達78.70%）作為模板進行SWISS-MODEL同源建模，發(fā)現(xiàn)該蛋白金屬結合位點為His4、His52、Asp141和 His145（圖4）。

圖4 GjMnSOD三級結構Fig. 4 Predicted tertiary structure of GjMnSOD

表1 GjMnSOD蛋白保守基序Table 1 GjMnSOD protein conserved motif

圖3 GjMnSOD二級結構預測結果Fig. 3 Prediction of secondary structure of GjMnSOD

2.4 GjMnSOD蛋白質(zhì)序列比對及系統(tǒng)進化分析結果

蛋白質(zhì)序列比對結果（圖5）顯示，GjMnSOD與刺苞菜薊、紫花苜蓿及萵苣等植物的MnSODs相似度較高，且 C端序列更為保守。GjMnSOD在141-148位氨基酸之間含有一個MnSOD特征序列（DVWEHAYY），再次說明其屬于MnSOD。GjMnSOD與刺苞菜薊（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）相似度最高，達93.86%。與紫花苜蓿、萵苣和向日葵MnSOD相似度也均高于92%，相似度分別為93.45%、92.58%和92.54%。進化樹分析結果也顯示非洲菊GjMnSOD與刺苞菜薊（Cynara cardunculus）MnSOD（XP_024979965.1）親緣關系最近（圖6）。此外，非洲菊GjMnSOD與萵苣、向日葵、刺苞菜薊和黃花蒿等菊科植物MnSODs聚在一支，木薯、海欖雌和松蒿MnSODs聚為另一支。

圖5 不同植物MnSOD蛋白序列多重比對結果Fig. 5 Multiple alignment results of MnSOD proteins from different plants

圖6 非洲菊GjMnSOD與其他植物MnSOD系統(tǒng)進化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of GjMnSOD in G. jamesonni and MnSOD proteins from other plants

2.5 實時熒光定量PCR結果

在IAA、GA3和SA等3種激素處理下，GjMnSOD相對表達量均顯著下調(diào)（圖7-A-C）。其中，IAA處理后下調(diào)最為明顯，在處理初期相對表達量即極顯著降低，處理12 h時達到最低值；GA3處理后，GjMnSOD相對表達量顯著下降，24 h時有所回升但仍顯著低于對照；SA處理后，GjMnSOD相對表達大致呈逐步降低的趨勢，24 h時僅約為對照組1/3。

鹽脅迫處理下，GjMnSOD表達受到抑制，呈“降-升-降”趨勢，處理4 h后相對表達量降為對照的2/5，8 h時表達量有所回升，但仍顯著低于對照，之后表達量顯著下降，并于24 h時達到最低值（圖7-D）。

在30% PEG模擬干旱脅迫下，GjMnSOD相對表達量呈現(xiàn)出“先降后升”的趨勢。處理1 h和2 h時，表達量顯著低于對照，4 h時顯著高于對照，并于6 h時達到最大值，約為對照組2.3倍（圖7-E）。

4℃低溫處理下，GjMnSOD基因的表達受到極顯著抑制（P＜0.01），低溫處理后各時間點的表達量均不足對照組1/5（圖7-F）。

圖7 激素與非生物脅迫處理對GjMnSOD相對表達量的影響Fig. 7 Effects of hormone and abiotic stresses on the relative expression of GjMnSOD

3 討論

本研究成功從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個SOD基因，其編碼蛋白具有經(jīng)典MnSOD的特征序列及保守結構域，與刺苞菜薊MnSOD相似度最高且親緣關系最近，亞細胞定位預測結果顯示該蛋白定位于線粒體，由此推斷其屬于線粒體MnSOD（命名為GjMnSOD）。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)GjMnSOD的表達受多種激素和非生物脅迫處理影響顯著。

3.1 GjMnSOD的表達受激素影響顯著，可能在非洲菊激素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用

研究表明，MnSOD基因的表達受激素含量和外源激素處理影響顯著［27］。如小麥CsMSD基因隨GA3處理時間的延長，表達水平逐步升高，并于48 h時達到峰值［28］；芥菜 BjMnSOD 受 SA 顯著誘導［29］；在IAA、GA3和SA處理下，香蕉MaMSD的表達均隨著處理時間延長而上調(diào)［30］。但也有一些MnSOD基因的表達受激素抑制，如番茄SlSOD7基因啟動子區(qū)雖然含有SA應答元件TCA-element，但在SA處理下表達水平明顯下調(diào)［13］；龍眼DlMSD的表達也受GA、IAA和SA顯著抑制［31］。本研究中，在IAA、GA3和SA等3種激素處理下，GjMnSOD基因的表達均顯著降低，暗示GjMnSOD在非洲菊激素穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

3.2 GjMnSOD參與非洲菊對多種非生物脅迫的響應

超氧化物歧化酶是一類金屬酶，MnSOD的表達受金屬離子影響顯著［14］。徐龍［32］的研究發(fā)現(xiàn)茄子SmMnSOD在0.15 mol/L NaCl處理6 h時的表達量約為對照的3.02倍。朱磊等［29］發(fā)現(xiàn)芥菜BjMnSOD的表達受150 mmol/L NaCl顯著誘導，處理36 h時表達量高達對照組的8.7倍。程華等［33］發(fā)現(xiàn)100 mmol/L NaCl處理后銀杏GbMnSOD的轉錄表達量明顯提升，約為對照組3.5倍。而劉家林等［34］發(fā)現(xiàn)水稻OsSOD7受鹽脅迫影響并不顯著，說明MnSOD在不同植物響應鹽脅迫過程中發(fā)揮的作用可能不同。本研究發(fā)現(xiàn)，GjMnSOD受NaCl脅迫顯著抑制，在處理8 h時表達量有所回升，說明其參與非洲菊抗鹽反應。

MnSOD與植物耐旱性息息相關［10］。研究發(fā)現(xiàn)不同植物MnSOD在干旱脅迫下的表達模式差異顯著。白三葉草MnSOD的表達在干旱脅迫12 h時表達量達到最大值［35］。而茄子SmMnSOD受干旱（20% PEG）誘導表達不顯著，僅在48 h時略高于對照［36］。本研究發(fā)現(xiàn)，GjMnSOD在30% PEG模擬干旱處理4 h時，其相對表達量極顯著高于對照組，6 h時表達量進一步升高，約為對照組的2.3倍，說明GjMnSOD在非洲菊遭受干旱脅迫4 h后表達量即出現(xiàn)顯著升高，從而在非洲菊抵御干旱過程中發(fā)揮重要作用。

MnSOD在植物抗寒反應中發(fā)揮著重要作用。Li等［37］發(fā)現(xiàn)蓮花NnMSD1在低溫誘導過程中表達量顯著高于對照，于24 h時達到峰值，約為對照8.6倍。曾小玲等［38］發(fā)現(xiàn)菜心BclMSD在低溫處理下表達量呈“升-降”趨勢，處理6 h時在根中的表達量最高。而茄子SmMnSOD在低溫脅迫下表達量呈現(xiàn)急劇下降趨勢，處理3 h時表達量僅約為對照的20%［37］。苜蓿MtMSD基因在低溫脅迫24 h時的表達也受到顯著抑制［39］。本研究中，GjMnSOD的表達受低溫脅迫抑制顯著，與雋加香等［40］研究番茄線粒體中的SOD在低溫脅迫下的結果相一致。前人研究表明，MnSOD活性與線粒體呼吸鏈的電子傳遞密切相關［38］，由此推測低溫下非洲菊呼吸速率的降低可能是GjMnSOD基因表達被抑制的原因。

4 結論

本研究成功克隆獲得一個非洲菊線粒體錳超氧化物酶基因GjMnSOD。該基因的表達受IAA、GA3、SA、鹽脅迫和低溫顯著抑制，但受干旱顯著誘導，說明作為一個線粒體SOD基因，GjMnSOD參與非洲菊激素和逆境脅迫響應，可能在非洲菊抵御干旱過程中發(fā)揮重要的正向調(diào)控作用。