李俊林 張煥朝 聶文婧 張海洋 王向譽(yù) 郭洪恩 韓蕾

（1. 山東省蠶業(yè)研究所，煙臺(tái) 264002；2. 南京林業(yè)大學(xué)，南京 210037；3. 魯東大學(xué)，煙臺(tái) 264025）

植物啟動(dòng)子在基因的表達(dá)調(diào)控中起關(guān)鍵作用，基因表達(dá)的時(shí)空特異性、組織特異性和條件特異性主要取決于基因的啟動(dòng)子。植物基因啟動(dòng)子是重要的順式作用元件，能夠在轉(zhuǎn)錄水平上參與并調(diào)控下游相應(yīng)基因表達(dá)，使植物能夠抵御外界各種環(huán)境脅迫［1-2］。因此，研究植物啟動(dòng)子有助于了解基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控表達(dá)模式及其調(diào)控機(jī)制，并應(yīng)用于基因工程中提高或改進(jìn)外源目的基因的表達(dá)。

干旱條件下，植物體內(nèi)ABA水平升高，保衛(wèi)細(xì)胞中的離子從細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)出，從而驅(qū)使氣孔關(guān)閉，減少蒸騰失水［3-4］。保衛(wèi)細(xì)胞外向整流鉀離子通道（guard cell outward rectifying K+channe，GORK）是擬南芥保衛(wèi)細(xì)胞唯一一個(gè)介導(dǎo)鉀離子外流的鉀離子通道，在氣孔關(guān)閉過(guò)程起重要作用［5-7］。擬南芥GORK在保衛(wèi)細(xì)胞、根及維管組織中表達(dá)，在轉(zhuǎn)錄水平上受干旱、鹽和冷脅迫誘導(dǎo)［8］。在保衛(wèi)細(xì)胞中，GORK的表達(dá)與分布對(duì)ABA不敏感，但其分布受細(xì)胞外鉀濃度影響［7-8］。但是，ABA對(duì)保衛(wèi)細(xì)胞外向整流鉀通道轉(zhuǎn)運(yùn)鉀離子有直接調(diào)控作用［9］。GORK也可通過(guò)蛋白磷酸酶（PP2C-type protein phosphatase，PP2CA）介導(dǎo)的信號(hào)途徑增強(qiáng)擬南芥對(duì)ABA的敏感性，并對(duì)高鹽和滲透脅迫的相關(guān)機(jī)制起到了負(fù)調(diào)節(jié)作用［10］。GORK通道可以作為細(xì)胞代謝的“主開(kāi)關(guān)”，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)以適應(yīng)環(huán)境條件的變化，從而最大限度地發(fā)揮植物的適應(yīng)潛力［11］。迄今為止，除了擬南芥GORK，Li等［12］曾報(bào)道蒙古沙冬青中一個(gè)與擬南芥GORK同源的外鉀離子通道AmGORK，該通道與擬南芥GORK電生理功能特征相似，但其體內(nèi)生理功能還未有報(bào)道。

蒙古沙冬青（Ammopiptanthus mongolicus）為豆科，沙冬青屬，是我國(guó)西北荒漠區(qū)特有的常綠旱生闊葉灌木，起源與第三紀(jì)，瀕危物種，國(guó)家三級(jí)保護(hù)植物［13-14］。常年生長(zhǎng)在年降水量不足100 mm，年蒸發(fā)量大于3 000 mm的極端干旱環(huán)境中，是研究植物抗旱機(jī)制的很好材料［15］。

本研究從蒙古沙冬青中克隆了外向鉀離子通道AmGORK的啟動(dòng)子序列，利用PlantCARE預(yù)測(cè)AmGORK啟動(dòng)子順式作用元件。將AmGORKpro定向替換植物表達(dá)載體Cambia1301的CaMV35S啟動(dòng)子，構(gòu)建重組載體Cambia1301-AmGORKpro-GUS，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入野生型擬南芥。組織化學(xué)染色和定量分析揭示該啟動(dòng)子對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)特性，為深入研究該基因在水分及養(yǎng)分利用、光合作用、抗旱等過(guò)程的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蒙古沙冬青（A. mongolicus）由甘肅民勤沙生植物園提供。擬南芥（Arabidopsis thaliana）哥倫比亞（Columbia）野生型和根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101為海水農(nóng)業(yè)實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌（Escherichia coli）Trans1-T1、Taq酶、限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 利用CTAB法提取蒙古沙冬青幼嫩葉片基因組DNA，微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 AmGORK基因5′側(cè)翼片段克隆 鑒于AmGORK啟動(dòng)子序列未知，參考Liu等［16］的方法進(jìn)行交錯(cuò)式熱不對(duì)稱(chēng)PCR法（thermal asymmetric interlaced PCR），以沙冬青基因組DNA為模板，根據(jù)前期已經(jīng)克隆得到的AmGORK序列，分別在其DNA序列ATG下游45、114和248 bp處設(shè)計(jì)3條反向引物GP1-3、GP1-2和GP1-1。為了增加PCR反應(yīng)特異性，在GP1-2引物前添加一段隨機(jī)引物序列。合成4條隨機(jī)引物L(fēng)AD1-1、LAD1-2、LAD1-3和LAD1-4以及1條引物AC1，具體序列見(jiàn)表1。

AmGORK的5′側(cè)翼片段的擴(kuò)增由3輪PCR完成，第一輪PCR反應(yīng)以沙冬青基因組DNA為模板，上游引物分別是4條隨機(jī)引物，下游引物是GP1-1；首輪PCR產(chǎn)物稀釋40倍后作為第二輪PCR反應(yīng)模板，上游引物為AC1，下游引物為GP1-2；第二輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍后作為第三輪PCR反應(yīng)模板，上游引物為AC1，下游引物為GP1-3。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，將PCR條帶切膠回收，與pMD19-T載體連接，送華大基因測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)引物（GP2-1、GP2-2和GP2-3），用同樣方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，直到獲得需要大小的目的片段。

1.2.3 AmGORK啟動(dòng)子的克隆及鑒定 根據(jù)上述測(cè)序得到的DNA拼接序列設(shè)計(jì)上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R（表1），并分別在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)。

表1 試驗(yàn)所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the experiment

以沙冬青基因組DNA為模板，用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。按照回收試劑盒說(shuō)明書(shū)回收目的片段。獲得的目的片段和pEasy-blunt zero載體（TransGen Biotech）連接，并轉(zhuǎn)化Trans1-T1，涂在含氨芐的平板上，挑取菌斑做菌落PCR鑒定，初步確認(rèn)為陽(yáng)性克隆后，送華大公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果正確，含有AmGORK啟動(dòng)子重組質(zhì)粒，保存待用。

1.2.4 AmGORK啟動(dòng)子序列的特征分析 通過(guò)在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行順式作用元件預(yù)測(cè)分析［17］。

1.2.5 AmGORK啟動(dòng)子植物表達(dá)載體的構(gòu)建 用KpnⅠ和NcoⅠ分別對(duì)上述測(cè)序正確的含有AmGORK啟動(dòng)子重組質(zhì)粒和植物表達(dá)載體pCambia1301-GUS進(jìn)行酶切、片段回收、純化、連接及陽(yáng)性克隆鑒定（圖 1）。

圖1 表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Construction map of expression vector

1.2.6 AmGORK啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化擬南芥 根據(jù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法，將Cambia1301-AmGORKPro-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的T0代種子播種于含有50 mg/L潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中，選取能夠長(zhǎng)出綠色真葉，根系較長(zhǎng)的抗性苗移栽到基質(zhì)中。

1.2.7 GUS組織化學(xué)染色 參考Han等［18］的方法，選取T3代純合轉(zhuǎn)基因擬南芥的不同組織置于GUS染色液中，37℃黑暗培養(yǎng)過(guò)夜，用梯度濃度酒精完全脫色，顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 AmGORK啟動(dòng)子的克隆

AmGORK的5′側(cè)翼片段的擴(kuò)增由3輪PCR完成（圖2-A），獲得約1 200 bp的序列。然后根據(jù)測(cè)得序列重新設(shè)計(jì)3條引物GP2-1、GP2-2和GP2-3（表1），繼續(xù)向5′側(cè)翼延伸（圖2-B）獲得500 bp左右的序列。將2次測(cè)得的序列拼接，刪除中間重復(fù)片段，得到長(zhǎng)度為1 723 bp的序列，命名為AmGORKpro。

圖2 AmGORK啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增Fig. 2 Amplification of AmGORK promoter sequence

根據(jù)上述拼接序列設(shè)計(jì)上游引物AmGORK-pro-F和下游引物AmGORK-pro-R，分別在引物5′端引入KpnⅠ和NcoⅠ酶切位點(diǎn)。以沙冬青基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增（圖2-C），得到2條約1 700 bp的特異條帶。將上述片段與pEasy-blunt zero載體（TransGen Biotech）連接，轉(zhuǎn)化Trans1-T1，進(jìn)行菌落PCR鑒定，初步確認(rèn)為陽(yáng)性克隆后測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果正確含有AmGORKpro的重組質(zhì)粒保存待用。

2.2 AmGORK啟動(dòng)子序列功能預(yù)測(cè)分析

利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)PlantCARE對(duì)AmGORK啟動(dòng)子序列的結(jié)構(gòu)特征及重要的順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果（表2）顯示，AmGORK啟動(dòng)子序列包含典型的TATA-box及CAAT-box。此外，還包含ABA響應(yīng)元件ABRE、赤霉素響應(yīng)元件GARE、干旱誘導(dǎo)元件MBS、低溫響應(yīng)元件LTR等各1個(gè)，及多個(gè)光響應(yīng)元件。表明AmGORK可能受到干旱、低溫等非生物脅迫或光信號(hào)的調(diào)控。

表2 AmGORK啟動(dòng)子序列預(yù)測(cè)分析Table 2 Prediction analysis of AmGORK promoter sequence

2.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的鑒定

根據(jù)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序侵染法，將Cambia1301-AmGORKPro-GUS轉(zhuǎn)化擬南芥。將收獲的T0代種子播種于含有潮霉素的1/2 MS培養(yǎng)基中，提取能夠長(zhǎng)出綠色真葉，根系較長(zhǎng)的抗性苗基因組DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3），抗性植株的PCR產(chǎn)物與目的條帶大小一致。初步證明目的基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥中。按照上述方法獲得T3代純合轉(zhuǎn)基因株系。

圖3 轉(zhuǎn)AmGORK擬南芥PCR鑒定結(jié)果Fig. 3 PCR validation of AmGORK transgenic A. thaliana

2.4 AmGORK啟動(dòng)子的組織表達(dá)特異性

構(gòu)建了Cambia1301-AmGORKpro-GUS植物表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)入擬南芥中，觀測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株GUS的表達(dá)情況（圖4），轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉片葉柄、葉脈、保衛(wèi)細(xì)胞和莖均有明顯的藍(lán)色GUS染色信號(hào)，表明AmGORK的表達(dá)在整個(gè)發(fā)育階段具有連續(xù)性。除了葉片，在主根中柱和花萼也有GUS的表達(dá)，表明AmGORK的表達(dá)具有組織特異性，并且主要在輸導(dǎo)組織中表達(dá)。

圖4 轉(zhuǎn)基因擬南芥中AmGORK啟動(dòng)子活性分析Fig.4 Activity analysis of AmGORK promoter in transgenic A. thaliana

2.5 逆境脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因幼苗AmGORK啟動(dòng)子活性的影響

為了研究非生物脅迫對(duì)擬南芥中AmGORK啟動(dòng)子活性的影響，對(duì)轉(zhuǎn)AmGORK啟動(dòng)子的擬南芥進(jìn)行PEG或ABA處理。定量表達(dá)分析顯示，PEG處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS表達(dá)為對(duì)照的3.2倍，ABA處理24 h后，轉(zhuǎn)基因植株葉片的GUS表達(dá)為對(duì)照的4.1倍（圖5）。以上結(jié)果表明，AmGORK啟動(dòng)子活性受PEG或ABA誘導(dǎo)。

圖5 不同處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片中GUS的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of GUS gene in the transgenic A. thaliana leaves under different treatments

3 討論

啟動(dòng)子位于基因上游，被RNA聚合酶特異性識(shí)別并結(jié)合的一段DNA序列，在轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)基因的表達(dá)起調(diào)控作用。啟動(dòng)子核心區(qū)域一般包括TATA-box和CAAT-box等模塊，這也是啟動(dòng)子的特征序列［19-20］。本研究通過(guò)生物信息學(xué)對(duì)克隆的AmGORKpro序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該序列含有多個(gè)TATA-box和CAAT-box，說(shuō)明該序列具有典型的啟動(dòng)子特征。除了這些核心特征序列外，啟動(dòng)子中還有很多特異的順式作用元件和非生物脅迫響應(yīng)元件［21-22］。研究結(jié)果顯示，AmGORK啟動(dòng)子序列內(nèi)包含干旱響應(yīng)相關(guān)元件、激素響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件等。啟動(dòng)子區(qū)域的干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件、ABA響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件與基因參與的逆境響應(yīng)和對(duì)應(yīng)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，而ABA和水楊酸介導(dǎo)植物對(duì)外界環(huán)境的響應(yīng)［23-25］。

擬南芥中2個(gè)外向型鉀離子通道分別為中柱鉀離子外向整流通道（stelar K+outward rectifier channel，SKOR）和GORK，SKOR主要在根中柱鞘和中柱薄壁細(xì)胞中表達(dá)［26］。GORK主要在保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其在根、葉、花和花粉中都有表達(dá)［6，8］。本研究結(jié)果顯示，AmGORK組織定位模式與擬南芥GORK基本一致，都在根中柱、葉脈、葉柄等輸導(dǎo)組織中表達(dá)。輸導(dǎo)組織是植物體中擔(dān)負(fù)物質(zhì)長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)闹饕M織，根從土壤中吸收的水分和無(wú)機(jī)鹽分，由輸導(dǎo)組織運(yùn)送到地上各個(gè)部位。植物組織間的物質(zhì)重新分配和轉(zhuǎn)移，也要通過(guò)輸導(dǎo)組織來(lái)進(jìn)行。AmGORK在輸導(dǎo)組織中表達(dá)，推測(cè)其可能參與植物水分或養(yǎng)分運(yùn)輸與再分配過(guò)程。此外，AmGORK啟動(dòng)子還存在數(shù)個(gè)“TAAAG”元件，這些元件能夠驅(qū)動(dòng)馬鈴薯鉀通道KST1在保衛(wèi)細(xì)胞中特異性表達(dá)［27］，同時(shí)，AmGORK在保衛(wèi)細(xì)胞中有強(qiáng)烈的GUS信號(hào)，表明AmGORK可能參與保衛(wèi)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)過(guò)程。植物遭遇干旱脅迫時(shí)，體內(nèi)ABA含量提高，ABA通過(guò)激活保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)Ca2+、K+及陰離子通道，使保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)離子外流，減少保衛(wèi)細(xì)胞滲透壓，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，從而適應(yīng)水分虧缺［28-29］。蒙古沙冬青幼苗受到PEG模擬水分脅迫及ABA處理2 d后，都能引起AmGORK表達(dá)上調(diào)［12］，有報(bào)道顯示，擬南芥外向整流鉀離子通道AtGORK受到干旱脅迫時(shí)，表達(dá)量也上調(diào)［8］，表明AmGORK可能參與干旱脅迫引起氣孔關(guān)閉過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究克隆并鑒定一個(gè)沙冬青外向鉀離子通道AmGORK的啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以驅(qū)動(dòng)外源基因在植物葉片葉脈、葉柄、氣孔、根系中柱和花萼中表達(dá)，且主要集中于葉脈、葉柄和根系的輸導(dǎo)組織。AmGORK啟動(dòng)子活性受PEG和ABA誘導(dǎo)。