孫 炎，劉千龍，羅肇河，康建華，孫秀武，張?jiān)獦?biāo)，林 輝，潘 鐘*

(1.自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門 361005；2.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102)

微塑料被定義為直徑小于5 mm的塑料顆粒，海洋中的塑料垃圾會(huì)經(jīng)過(guò)一系列的物理、化學(xué)或生物過(guò)程分解成為微塑料。聚苯乙烯(Polystyrene, PS)是廣泛使用的熱塑性塑料之一，內(nèi)部化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，不易降解，容易造成環(huán)境污染[1]。1990年后，我國(guó)對(duì)聚苯乙烯的需求大幅增加，年消費(fèi)量都在10萬(wàn)噸以上[2]。大量塑料制品的生產(chǎn)和使用，使得塑料垃圾在海洋水體中不斷累積，微塑料廣泛存在于近岸和大洋水體、生物體和深海沉積物等環(huán)境介質(zhì)中[3-6]，嚴(yán)重威脅海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定[7]。我國(guó)東海表層海水中微塑料的平均豐度為0.31 個(gè)/m3，在世界海域中處于中等水平[8]，因此，東海海域的微塑料污染問(wèn)題不容忽視。

東海原甲藻(Prorocentrumdonghaiense)屬于甲藻綱，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻屬。東海原甲藻生長(zhǎng)周期短，易于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)、觀測(cè)，適宜東海原甲藻生長(zhǎng)的最佳溫度約為20 ℃，最佳鹽度在20～40之間[9]。我國(guó)赤潮災(zāi)害頻發(fā)，2018年，我國(guó)管轄海域共發(fā)現(xiàn)36次赤潮事件，其中大部分發(fā)生在東海[10]。東海原甲藻是我國(guó)東海海域常見(jiàn)的有害赤潮藻[11]，該藻暴發(fā)形成赤潮后，對(duì)海洋生態(tài)的危害大且難以控制[12]。

有毒有害微藻會(huì)寄生在海洋塑料垃圾碎片上，并可通過(guò)塑料碎片在海洋環(huán)境中傳播[13]。Bergami等(2017)研究表明聚苯乙烯納米微塑料對(duì)杜氏藻(Dunaliellatertiolecta)的生長(zhǎng)具有長(zhǎng)期毒性[14]。Sjollema等(2016)利用脈沖振幅調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定聚苯乙烯微塑料對(duì)鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)光合作用的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度(250 mg/L)、小粒徑(0.05 μm)條件下的微塑料對(duì)藻的抑制作用更強(qiáng)[15]。Wu等(2019)研究發(fā)現(xiàn)聚丙烯(Polypropylene, PP)和聚氯乙烯(Polyvinylchloride, PVC)微塑料會(huì)影響蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)的光合作用，聚丙烯或聚氯乙烯微塑料的濃度越高，蛋白核小球藻的光合作用活性越低，且聚氯乙烯的抑制效應(yīng)大于聚丙烯[16]。Lagarde等(2016)對(duì)聚丙烯和萊茵衣藻(Chlamydomasreinhardtii)之間的相互作用進(jìn)行了研究，微塑料濃度設(shè)置為400 mg/L、粒徑設(shè)置為400～1 000 μm，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)第一天萊茵衣藻的生長(zhǎng)并未受聚丙烯微塑料的影響，實(shí)驗(yàn)20 d后，微藻、微塑料和胞外多糖會(huì)形成密度為1.2 g/cm3的異質(zhì)聚集體，該聚集體會(huì)沉降到錐形瓶底部[17]。Zhang等(2017)研究發(fā)現(xiàn)平均直徑為1 μm的聚氯乙烯微塑料對(duì)中肋骨條藻(Skeletonemacostatum)的生長(zhǎng)和光合作用有明顯的抑制[18]。微藻作為海洋中的一種微生物，是海洋食物鏈底端的的生產(chǎn)者，是全球氧氣的主要來(lái)源，對(duì)于維持水生生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性起著重要的作用[19]，微塑料污染作為當(dāng)今世界四大環(huán)境問(wèn)題之一，從2004年至今不斷引起科學(xué)界的關(guān)注與研究[20]，本研究擬通過(guò)設(shè)計(jì)不同粒徑和濃度的聚苯乙烯微塑料及在不同濃度溶解性有機(jī)質(zhì)溶液(DOM)的情況下對(duì)東海原甲藻的差異化暴露實(shí)驗(yàn)，觀察東海原甲藻的生長(zhǎng)狀況，探討聚苯乙烯微塑料對(duì)東海原甲藻生長(zhǎng)的影響機(jī)制，從而為微塑料和赤潮藻的復(fù)合污染帶來(lái)的生態(tài)效應(yīng)以及海洋生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

東海原甲藻由自然資源部第三海洋研究所海洋生物與生態(tài)實(shí)驗(yàn)室藻種庫(kù)提供。聚苯乙烯微球購(gòu)自天津倍思樂(lè)公司，粒徑為0.1 μm和1.0 μm。

設(shè)備：光學(xué)顯微鏡(Olympus CKX41)、消毒滅菌鍋(BXM-30R，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、光照培養(yǎng)箱(GXZ-280，寧波江南儀器廠)、錐形瓶(500 mL，蜀玻)、0.5 mL藻類計(jì)數(shù)框(XKJ-05S，廈門登迅儀器設(shè)備有限公司)。

魯哥氏液：5 g碘和10 g碘化鉀溶于85 mL蒸餾水中配置而成，避光保存。

f/2培養(yǎng)基：天然海水過(guò)濾，煮沸滅菌，pH調(diào)節(jié)至8，鹽度調(diào)節(jié)至30.0±0.1，每1 L培養(yǎng)基中加入1 mL 75 g/L NaNO3、1 mL 5 g/L NaH2PO4·2H2O、1 mL痕量金屬溶液和0.5 mL維生素溶液。

溶解性有機(jī)質(zhì)溶液：稱取2.0 g溶解性有機(jī)質(zhì)(Alfa Aesar)于500 mL 燒杯中，攪拌使固體完全溶解，將燒杯中的液體轉(zhuǎn)移至1 000 mL容量瓶中，并用去離子水定容至容量瓶刻度標(biāo)線，配置成2 000 mg/L的溶解性有機(jī)質(zhì)溶液，搖勻待用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

f/2培養(yǎng)基中DOM濃度測(cè)定: 采集水樣儲(chǔ)存于60 cm3經(jīng)過(guò)前處理的棕色玻璃瓶中，加磷酸酸化至pH<2，在-20 ℃條件下密封保存；測(cè)定時(shí)，將樣品充分解凍，然后用島津 TOC-VCPH型總有機(jī)碳分析儀分析，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(CV)<2%，測(cè)得f/2培養(yǎng)基中的DOM含量為1 mg/L。

取500 mL f/2培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的錐形瓶(500 mL)中，接種生長(zhǎng)狀態(tài)良好的東海原甲藻，接種密度為3.2×105個(gè)/L，使東海原甲藻處于生長(zhǎng)遲滯期。按表1所示加入聚苯乙烯微塑料設(shè)置0、1、2、3、4、5六個(gè)實(shí)驗(yàn)組，其中0號(hào)為對(duì)照組，5號(hào)中加入1 mL配置好的溶解性有機(jī)質(zhì)溶液，使培養(yǎng)基中的DOM濃度為5 mg/L。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置2個(gè)平行樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件設(shè)置為溫度20 ℃，光暗比L∶D=12 h∶12 h，光照強(qiáng)度為90 μmol/(m2·s)。前期每2 d取樣一次，中期和后期每1 d取樣一次，測(cè)量藻密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)剩余藻液的體積應(yīng)大于初始藻液體積的1/2。

表1 微塑料暴露實(shí)驗(yàn)方案設(shè)置

藻密度測(cè)定：取100 μL藻液于10×10格的0.5 mL藻類計(jì)數(shù)框上，再加入300 μL魯哥氏液固定藻，然后用光學(xué)顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)樣品計(jì)數(shù)2次，取其平均值，記錄細(xì)胞數(shù)量。

生長(zhǎng)速率測(cè)定的計(jì)算公式如下。

(1)

式(1)中:C為生長(zhǎng)速率[個(gè)/(L·d)]，N2和N1分別為時(shí)間t2(d)和t1(d)時(shí)的藻細(xì)胞密度(個(gè)/L)。

采用Origin 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與討論

東海原甲藻作為我國(guó)東部沿海常見(jiàn)的赤潮藻[21]，在微塑料污染普遍存在的東海海域，可能與微塑料發(fā)生大概率的相互作用。廣泛分布的微塑料影響藻類的生長(zhǎng)，繼而影響生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定。本研究對(duì)東海原甲藻在聚苯乙烯微塑料差異化暴露條件下的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行了探討，設(shè)置初始藻密度為3.2×105個(gè)/L，基于預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)定藻體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)周期為19 d，圖1顯示六個(gè)實(shí)驗(yàn)組在微塑料暴露條件下的不同生長(zhǎng)情況。

圖1 東海原甲藻在不同微塑料暴露條件下的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)曲線

實(shí)驗(yàn)組0、1、3、4體現(xiàn)了藻類生長(zhǎng)的4個(gè)時(shí)期已在圖1中標(biāo)出：遲滯期(第1—3天)、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(第3—9天)、穩(wěn)定期(第9—14天)、衰退期(第14—19天)。在遲滯期和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，4個(gè)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組的藻密度差別較小，但在穩(wěn)定期和衰退期呈現(xiàn)明顯的差別，其中，實(shí)驗(yàn)組0(0 μm、0 mg/L)的藻密度最大，說(shuō)明微塑料會(huì)抑制藻在穩(wěn)定期和衰退期的生長(zhǎng)。

在穩(wěn)定期和衰退期，藻密度大小為實(shí)驗(yàn)組3(1.0 μm、1 mg/L)>實(shí)驗(yàn)組1(0.1 μm、1 mg/L)，說(shuō)明微塑料粒徑越小，對(duì)藻的抑制作用越強(qiáng)。微塑料對(duì)藻的毒性強(qiáng)弱與其粒徑大小相關(guān)，本次實(shí)驗(yàn)選取的微塑料粒徑較小(0.1 μm和1.0 μm)，而東海原甲藻細(xì)胞較大，體長(zhǎng)可達(dá)16～22 μm[27]，當(dāng)微塑料和藻細(xì)胞接觸時(shí)，可能會(huì)堵塞藻細(xì)胞氣孔，降低養(yǎng)分和氣體交換[28]，從而抑制藻的生長(zhǎng)。小粒徑的微塑料還可能通過(guò)氣孔進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部引起細(xì)胞機(jī)械損傷。微塑料進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部后，可能會(huì)引發(fā)部分細(xì)胞器的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。微塑料粒徑越小，越易造成氣孔堵塞或進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)而引起細(xì)胞機(jī)械損傷、降低養(yǎng)分和氣體交換，從而對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)。在實(shí)驗(yàn)組1(0.1 μm、1 mg/L)、實(shí)驗(yàn)組3(1.0 μm、1 mg/L)和實(shí)驗(yàn)組4(1.0 μm、10 mg/L)藻生長(zhǎng)的穩(wěn)定期和衰退期中，藻生長(zhǎng)抑制作用強(qiáng)弱大小為實(shí)驗(yàn)組4>1>3，表明在這兩個(gè)時(shí)期內(nèi)濃度的抑制效果強(qiáng)于粒徑，可能的原因是聚苯乙烯微塑料的遮光效應(yīng)大于細(xì)胞損傷效應(yīng)。

與實(shí)驗(yàn)組1(0.1 μm、1 mg/L)和實(shí)驗(yàn)組4(1 μm、10 mg/L)相比，實(shí)驗(yàn)組2(0.1 μm、10 mg/L)在藻的遲滯期和對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期早期生長(zhǎng)緩慢，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后期生長(zhǎng)快且藻密度較大，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后藻密度仍在增長(zhǎng)。說(shuō)明在小粒徑(0.1 μm)和高濃度(10 mg/L)條件同時(shí)存在下的聚苯乙烯微塑料對(duì)東海原甲藻前期的生長(zhǎng)影響表現(xiàn)為先抑制、后促進(jìn)。納米塑料在生物體內(nèi)容易發(fā)生聚集，而且排出緩慢，從而在細(xì)胞和分子層面上具有明顯的毒性效應(yīng)[29]。0.1 μm的微塑料已經(jīng)達(dá)到納米級(jí)別，且在10 mg/L的高濃度下對(duì)東海原甲藻造成強(qiáng)烈的抑制效應(yīng)，導(dǎo)致藻在生長(zhǎng)前期就出現(xiàn)細(xì)胞損傷、氣體交換減弱等現(xiàn)象，藻密度增長(zhǎng)緩慢。東海原甲藻在其生長(zhǎng)后期生長(zhǎng)速率加快的原因可能如下：細(xì)胞受外因脅迫自身調(diào)節(jié)，使細(xì)胞壁增厚[30]，從而有效地阻擋微塑料的入侵，避免細(xì)胞損傷；藻類的同質(zhì)聚集[31]，藻細(xì)胞通過(guò)形成群落而降低其細(xì)胞表面體積比，減少微塑料在其表面的吸附，從而保護(hù)藻細(xì)胞不受進(jìn)一步損害。

圖2顯示了第1—9天內(nèi)東海原甲藻的生長(zhǎng)速率變化情況。實(shí)驗(yàn)組0～5的平均生長(zhǎng)速率分別為0.53、0.53、0.15、0.52、0.51、0.55 個(gè)/(L·d)。實(shí)驗(yàn)組0、1、3、4在第1—9天內(nèi)的生長(zhǎng)速率均隨時(shí)間的增加而減小，可能的原因是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基中的N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗而得不到補(bǔ)充，導(dǎo)致藻的生長(zhǎng)速率降低[38]。實(shí)驗(yàn)組5(1.0 μm、10 mg/L，DOM濃度為5 mg/L)的平均生長(zhǎng)速率最大，說(shuō)明高濃度的溶解性有機(jī)質(zhì)促進(jìn)了東海原甲藻的生長(zhǎng)，這可能由于溶解性有機(jī)質(zhì)攜帶或分解產(chǎn)生氮磷無(wú)機(jī)鹽[33,36]或腐殖酸吸附微塑料從而降低微塑料對(duì)藻生長(zhǎng)的抑制[37]。實(shí)驗(yàn)組5在D3—D5天和D5—D7天的生長(zhǎng)速率相同，均為0.53個(gè)/(L·d)，后一時(shí)間段維持了前一時(shí)間的生長(zhǎng)趨勢(shì)，這也進(jìn)一步證明了具有高濃度(DOM濃度為5 mg/L)溶解性有機(jī)質(zhì)的實(shí)驗(yàn)組5中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)較其他實(shí)驗(yàn)組充足，溶解性有機(jī)質(zhì)攜帶或分解產(chǎn)生氮磷無(wú)機(jī)鹽[33,36]為維持藻較快的生長(zhǎng)帶來(lái)了額外的營(yíng)養(yǎng)源補(bǔ)充。實(shí)驗(yàn)組2(0.1 μm、10 mg/L)的初始生長(zhǎng)速率最小，為-1.04 個(gè)/(L·d)，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)其藻生長(zhǎng)受到微塑料的強(qiáng)烈抑制，這也充分表明了微塑料顆粒的低粒徑效應(yīng)明顯強(qiáng)于高粒徑顆粒；在D7—D9天，實(shí)驗(yàn)組2的生長(zhǎng)速率最大，為0.65 個(gè)/(L·d)，顯著大于其他實(shí)驗(yàn)組，藻表現(xiàn)出明顯的增長(zhǎng)趨勢(shì)，表明0.1 μm、10 mg/L的聚苯乙烯微塑料對(duì)東海原甲藻第1—9天內(nèi)生長(zhǎng)趨勢(shì)的表現(xiàn)為先抑制、后促進(jìn)。

圖2 各實(shí)驗(yàn)組中藻的生長(zhǎng)速率變化

3 結(jié)論

本研究通過(guò)聚苯乙烯微塑料差異化暴露實(shí)驗(yàn)，觀察了東海原甲藻的生長(zhǎng)情況，測(cè)量了藻密度和生長(zhǎng)速率的變化，獲得如下結(jié)論：

(1)DOM的加入促進(jìn)了東海原甲藻的生長(zhǎng)，在小粒徑(0.1 μm)和高濃度(10 mg/L)條件同時(shí)存在下的聚苯乙烯微塑料對(duì)東海原甲藻前期的生長(zhǎng)影響表現(xiàn)為先抑制、后促進(jìn)。

(2)聚苯乙烯微塑料會(huì)抑制東海原甲藻在穩(wěn)定期和衰退期的生長(zhǎng)，微塑料粒徑越小、濃度越高抑制作用越強(qiáng)。

(3)后續(xù)研究可進(jìn)一步從更多層面測(cè)定微藻的生長(zhǎng)狀況，比如測(cè)定藻細(xì)胞的實(shí)際光合效率、觀察培養(yǎng)基中N和P的變化、對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定透射電子顯微鏡(TEM)切片分析從而在細(xì)胞器層面解釋毒性機(jī)理等，獲取更多有代表性的數(shù)據(jù)，為全面了解微塑料對(duì)東海原甲藻的生態(tài)生理效應(yīng)提供理論支撐。