楊盛昌，盧 磊，諸 姮，李文清

(1.廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、濱海濕地生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102；2.福建省濱海濕地保護(hù)與生態(tài)恢復(fù)工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361102)

桐花樹(Aegicerascorniculatum)是紫金?？疲┗鋵?Aegiceras)的紅樹植物，在我國的廣東、廣西、福建均有大面積的分布。桐花樹生長在海岸潮間帶，水淹、高鹽、缺氧和潮水周期性的沖刷等逆境導(dǎo)致了其形成泌鹽、胎生等特殊的適應(yīng)方式[1]。

所謂胎生，是指種子成熟后不經(jīng)過休眠或只有短暫的休眠直接在母體上萌發(fā)的現(xiàn)象[1-2]。紅樹植物的胎生可分為兩種方式，即顯胎生和隱胎生。顯胎生的種子在萌發(fā)時(shí)，胚軸突破果皮之外逐漸延伸長成一個(gè)柱狀的幼苗，具顯胎生現(xiàn)象的紅樹植物以紅樹科的紅樹屬(Rhizophora)、秋茄屬(Kandelia)和木欖屬(Bruguiera)等為主；隱胎生的種子萌發(fā)時(shí)胚軸并不會(huì)突破果皮而一直為果皮所包被，以桐花樹屬和海欖雌屬(Avicennia)紅樹植物為代表。有關(guān)胎生的形態(tài)描述很多，如Juncosa(1982、1984)曾研究了美國紅樹(Rhizophoramangle)和毛瓣木欖(Bruguieraexaristata)的胚胎發(fā)生和幼苗形態(tài)變化[3-4]。Farrant 等(1993)認(rèn)為紅樹屬和海欖雌屬紅樹的胎生是跳過成熟干燥期的胚胎發(fā)育過程[5]。游學(xué)明等(2005)則研究胎生紅樹植物桐花樹大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程，發(fā)現(xiàn)胎生桐花樹的大小孢子發(fā)生及雌雄配子體發(fā)育過程與典型的非胎生陸生植物相似[6]。在紅樹植物胎生機(jī)制的研究方面，Sussex(1975)曾提出美國紅樹種胚在發(fā)育后期不會(huì)脫水，無法誘導(dǎo)內(nèi)源性脫落酸(Abscisic Acid，ABA；化學(xué)式C15H20O4)的合成從而導(dǎo)致胎生，并且幼胚離體培養(yǎng)試驗(yàn)也表明幼胚不能吸收外源性ABA[7]。Farnsworth等(1998)則通過比較胎生和非胎生紅樹植物的內(nèi)源性ABA含量，證實(shí)胎生紅樹植物成熟種子缺少休眠階段與其內(nèi)源性ABA含量低有關(guān)[8]。進(jìn)一步的研究表明，胎生和非胎生紅樹植物的內(nèi)源性ABA含量受鹽漬環(huán)境影響，但在胎生過程中的變化趨勢不會(huì)改變[9]。Ismial等(2010)認(rèn)為在大紅樹(Rhizophoramucronata)的胎生發(fā)育過程中，ABA能調(diào)控脫水蛋白的特異性表達(dá)，其中50 kD的縮水蛋白與胎生的啟動(dòng)相關(guān)[10]。胎生過程體現(xiàn)了紅樹植物從外在形態(tài)發(fā)育到內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制的適應(yīng)，從分子機(jī)理與調(diào)控機(jī)制角度研究紅樹植物胎生過程揭示胎生現(xiàn)象的本質(zhì)對(duì)理解紅樹植物胎生本質(zhì)具有重要的意義[11]。

在植物生長發(fā)育過程中，內(nèi)源性赤霉素(Gibberellin，GA；化學(xué)式C19H22O6)與ABA存在一定的拮抗作用，例如ABA能誘導(dǎo)種子休眠，抑制早萌發(fā)生，但GA卻使種子休眠解除[12]，植物可以通過控制兩種激素的相對(duì)平衡調(diào)節(jié)萌發(fā)和休眠[13]。GA是廣泛存在的一種植物激素，化學(xué)結(jié)構(gòu)屬于二萜類酸，由四環(huán)骨架衍生而得，至少有38種，分別被稱為GA1、GA2、GA3……等，其中GA3含量較高，活性較強(qiáng)[14]。紅樹植物胎生與其內(nèi)源性ABA含量低有關(guān)，那么內(nèi)源性GA是否參與紅樹的胎生過程？王潔等(2008)曾采用高效液相色譜法測定了顯胎生紅樹植物木欖(Bruguieragymnorhiza)繁殖體的內(nèi)源性ABA和GA3含量，發(fā)現(xiàn)GA3在木欖的種子形成和萌發(fā)早期含量較高，而ABA含量較低，認(rèn)為高水平GA3與木欖紅樹植物顯胎生現(xiàn)象的發(fā)生有關(guān)[14]。本研究以隱胎生紅樹植物桐花樹為材料，研究了其在不同胎生發(fā)育時(shí)期繁殖體的內(nèi)源性ABA和GA3含量變化，同時(shí)測定了受兩種生長調(diào)節(jié)激素直接調(diào)控的淀粉和可溶性糖含量的變化，希冀能進(jìn)一步明確紅樹植物胎生過程中內(nèi)源性ABA、GA3含量及其比例的變化規(guī)律，并從ABA和GA3的協(xié)同調(diào)控角度，豐富對(duì)紅樹植物胎生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集和保存

桐花樹的花蕾、種子(未見胚軸萌動(dòng))、萌發(fā)早期繁殖體(幼胚軸長約為8 mm)、萌發(fā)晚期繁殖體(胚軸長約為4.5 cm，外表黃褐色，已成熟，即將脫離母體)采于福建省云霄縣漳江口紅樹林國家級(jí)保護(hù)區(qū)(23°53′—23°56′N，117°24′—117°30′E)，時(shí)間為2011年4—5月。在桐花樹的不同物候期，采取相應(yīng)材料5份，每份質(zhì)量約為50 g，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-70 ℃冰箱中保存。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)用主要儀器包括Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)、SDS紫外檢測器(美國安捷倫科技有限公司)、Hypersil ODS柱[4.6 mm i.d.(250 mm, 5 μm)](美國賽默飛世爾科技公司)、Thermo紫外分光光度計(jì)(美國賽默飛世爾科技公司)、SHZ-3循環(huán)水真空泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)、RE 52-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)等。

1.3 試劑

ABA、GA3標(biāo)樣和聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)均購自美國Sigma公司，色譜級(jí)甲醇購自國藥集團(tuán)，濃硫酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%)、蒽酮以及其他試劑均為國藥集團(tuán)的分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.4 分析方法

樣品的處理參考文獻(xiàn)[14]并略加改進(jìn)，增加了乙酸乙酯(體積分?jǐn)?shù)為80%)萃取的次數(shù)以提高ABA和GA3的回收量。

色譜條件：Hypersil ODS 色譜柱[4.6 mm i.d.(250 mm，5 μm)]，流動(dòng)相為35%(體積分?jǐn)?shù))的甲醇(含 0.15% 0.1 mol/L H3PO4)，其流速為1.0 mL/min, 檢測波長分別為 245 nm和 208 nm，用于ABA和GA3含量的測定，進(jìn)樣量均為 20 μL，柱溫為30 ℃。

可溶性糖和淀粉含量的測定分別參照李合生(2000)[15]和鄒琦(2000)[16]的方法。

每一指標(biāo)重復(fù)測定5次。采用單因素方差分析法(One-way ANOVA)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 ABA和GA3含量的高效液相色譜法測定

采用外標(biāo)峰面積法測定ABA和GA3含量。用色譜峰面積分別對(duì)ABA和GA3含量作線性回歸曲線，計(jì)算得到的ABA和GA3標(biāo)準(zhǔn)工作曲線方程分別為ABA：y=142 762x+3.260 4(R2=0.994 2，p<0.01)；GA3：y=640 35x-60.188(R2=0.992 2,p<0.01)。

2.2 桐花樹胎生過程中內(nèi)源性GA3和ABA含量的變化

桐花樹胎生過程中不同繁殖體內(nèi)源性GA3和ABA含量的變化如圖1所示。從花蕾期到種子萌發(fā)晚期，內(nèi)源性GA3含量呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢，即從花蕾期到種子期，GA3含量迅速提高，并在種子期達(dá)到最高值，為(12.60±0.05)μg/g；然后隨種子萌發(fā)，GA3含量快速下降，并在種子萌發(fā)晚期達(dá)到最低值，為(1.97±0.05)μg/g。不同發(fā)育時(shí)期的ABA含量變化趨勢則表現(xiàn)為先降低后升高的趨勢，花蕾期ABA含量最高，為(1.86±0.07)μg/g，種子期迅速下降至最低值，為(0.75±0.07)μg/g，種子萌發(fā)之后，ABA含量逐漸上升。

圖1 桐花樹胎生過程中GA3和ABA 含量的變化

桐花樹的繁殖體隨著胚胎發(fā)育進(jìn)程，GA3/ABA含量比值的變化趨勢是先升高后降低(圖2)。種子期GA3/ABA含量比值最高，達(dá)到47.01，約為花蕾期的18倍。種子萌發(fā)早期GA3/ABA含量的比值明顯下降，但仍高于花蕾期和種子萌發(fā)晚期，花蕾期和種子萌發(fā)晚期GA3/ABA含量比值較小且差別不大。

圖2 桐花樹胎生過程中GA3/ABA含量比值的變化

2.3 桐花樹胎生過程中可溶性糖和淀粉含量變化

在不同發(fā)育時(shí)期，桐花樹繁殖體的可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢(圖3)?；ɡ倨诳扇苄蕴呛孔畹?，為(9.39±2.15)mg/g，種子期提高到(18.10±1.14)mg/g，種子萌發(fā)早期可溶性糖含量達(dá)到最高值，為(31.20±0.97)mg/g，萌發(fā)晚期則下降到與種子期相當(dāng)?shù)乃健ｋS著胎生發(fā)育進(jìn)程，桐花樹繁殖體的淀粉含量呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，即花蕾期淀粉含量最低，種子萌發(fā)晚期淀粉含量最高，萌發(fā)晚期淀粉的含量約為花蕾期的3倍，種子期與萌發(fā)早期的淀粉含量相差不大。

圖3 桐花樹胎生過程中可溶性糖和淀粉含量的變化

在不同發(fā)育時(shí)期，桐花樹繁殖體的可溶性糖/淀粉含量比值出現(xiàn)波動(dòng)，從花蕾期到萌發(fā)晚期比值呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象(圖4)。最高值出現(xiàn)在種子萌發(fā)早期，達(dá)0.90±0.12，種子萌發(fā)晚期降至最低值，為0.33±0.04，花蕾期與種子期的可溶性糖/淀粉含量比值相差不大。

圖4 桐花樹胎生過程中可溶性糖/淀粉含量比值的變化

2.4 討論

2.4.1 內(nèi)源性激素與紅樹植物胎生的關(guān)系 有關(guān)紅樹植物胎生現(xiàn)象與內(nèi)源性GA3關(guān)系的研究較少[14]。Farnsworth(2000)在其綜述文章中指出紅樹內(nèi)源性GA3可能參與了胎生過程，但未有相關(guān)數(shù)據(jù)的支持[2]。非胎生植物的種子內(nèi)源性GA3含量通常很低[17-18]，而本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果卻顯示桐花樹胎生種子有高含量的內(nèi)源性GA3，其含量超過了種子形成期和種子萌發(fā)后的各個(gè)時(shí)期。王潔等(2008)對(duì)紅樹植物木欖繁殖體的研究也得到相似的結(jié)果[14]。繁殖體內(nèi)源性GA3含量水平的大幅度變化表明內(nèi)源性GA3對(duì)紅樹植物種子的胎生可能起到了顯著的促進(jìn)作用。

大量研究結(jié)果表明，ABA能夠抑制離體種胚體外培養(yǎng)過程中的早萌發(fā)生，促進(jìn)貯藏蛋白質(zhì)的積累和胚的發(fā)育，是導(dǎo)致很多植物種子休眠的原因[16-17]。因此，種子胎生可能是因?yàn)榉N子中缺少ABA或者雖然ABA含量正常但種胚對(duì)ABA敏感性較低造成的[2,5-6]。已有研究表明，在高等植物中ABA合成可能是以類胡蘿卜素為前體的間接途徑，所以類胡蘿卜素的生物合成途徑中如有一步反應(yīng)被抑制或從類胡蘿卜素向ABA轉(zhuǎn)化受到抑制，都會(huì)導(dǎo)致種子中ABA缺乏[2]。本實(shí)驗(yàn)研究表明：桐花樹繁殖體在整個(gè)發(fā)育時(shí)期的內(nèi)源性ABA含量都很低，并且波動(dòng)較小，其中種子期的內(nèi)源性ABA含量最低，花蕾期內(nèi)源性ABA含量最高。這種現(xiàn)象在木欖[14]、正紅樹(Rhizophoraapiculata)和紅海欖(Rhizophorastylosa)等紅樹植物[8]中都有報(bào)道。紅樹植物種子中低水平的內(nèi)源性ABA難以誘導(dǎo)種子進(jìn)入休眠狀態(tài)，因此導(dǎo)致紅樹植物胎生現(xiàn)象的發(fā)生[2,8,14]。

桐花樹種子期的GA3/ABA含量比值最大，為花蕾期和種子萌發(fā)晚期的18倍。種子萌發(fā)早期的GA3/ABA含量比值雖有明顯下降，約為種子期的1/4，但仍維持比花蕾期和種子萌發(fā)晚期高的含量比值，其意義可能在于維持種子的持續(xù)萌發(fā)和促進(jìn)生長。此外，與單一GA3或ABA的含量變化相比，GA3/ABA含量比值的變化幅度更為顯著，因此，GA3/ABA的含量比值變化能更為明顯地表征紅樹植物胎生的發(fā)生，同時(shí)，該含量比值也能反映內(nèi)源性GA3和ABA對(duì)紅樹植物胎生過程的協(xié)同調(diào)控作用。

2.4.2 糖分含量與紅樹植物胎生的關(guān)系 植物中的可溶性糖主要包括果糖、葡萄糖等還原性糖和蔗糖。還原性糖是呼吸作用的直接底物，其含量大小可反映植物用于呼吸消耗的同化產(chǎn)物的水平；蔗糖則是植物體內(nèi)有機(jī)物質(zhì)運(yùn)輸和碳水化合物貯藏、積累的主要形式之一[19]。

通常情況下，植物種子休眠時(shí)可溶性糖水平較低，代謝水平低下[12]，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)桐花樹在種子期仍有較高水平的可溶性糖含量，說明桐花樹在種子形成過程中細(xì)胞代謝活動(dòng)旺盛，同時(shí)也表明桐花樹植物種子缺少休眠期，換言之，桐花樹植物種子形成后立即萌發(fā)，啟動(dòng)了胎生進(jìn)程。

種子進(jìn)入萌發(fā)晚期時(shí)，桐花樹繁殖體的可溶性糖水平出現(xiàn)大幅度下降，這可能是由于可溶性糖轉(zhuǎn)變成了貯存物質(zhì)淀粉的緣故，從而使生長進(jìn)入相對(duì)的停滯期。淀粉含量在桐花樹胎生過程中的上升趨勢也與上述判斷吻合。種子萌發(fā)晚期桐花樹繁殖體的淀粉含量達(dá)到最高，可以保障成熟胚軸掉落海灘后生長發(fā)育所需的物質(zhì)儲(chǔ)備和能量供給，也是紅樹植物胎生的適應(yīng)機(jī)制之一。

桐花樹可溶性糖/淀粉含量比值在種子萌發(fā)早期達(dá)到最大值，在種子萌發(fā)晚期降至最小。這可能是由于種子萌發(fā)早期細(xì)胞新陳代謝旺盛，淀粉水解為可溶性糖能供生長發(fā)育使用；在種子萌發(fā)晚期細(xì)胞新陳代謝減弱，大量可溶性糖合成淀粉，生長出現(xiàn)短暫停滯，導(dǎo)致了可溶性糖/淀粉含量比值變小。

2.4.3 胎生過程中內(nèi)源性激素與糖分含量變化的關(guān)系 研究認(rèn)為內(nèi)源性GA3可能是啟動(dòng)α-淀粉酶合成的植物激素，它可以促進(jìn)α-淀粉酶在糊粉層細(xì)胞中的表達(dá)[20]。ABA則起著抑制萌發(fā)、誘導(dǎo)休眠的作用，它對(duì)種子貯藏物代謝相關(guān)的淀粉酶等具有抑制作用[18]。Karine等(2002)研究發(fā)現(xiàn)大麥糊粉層中，ABA阻礙α-淀粉酶的積累，而GA則促進(jìn)α-淀粉酶的表達(dá)[15]。

通過比較桐花樹繁殖體在不同發(fā)育時(shí)期的GA3/ABA含量比值和可溶性糖/淀粉含量比值可以發(fā)現(xiàn)，花蕾期桐花樹的GA3/ABA含量比值很小，可溶性糖/淀粉含量比值也較低；種子期桐花樹繁殖體的GA3/ABA含量比值達(dá)最高水平，但可溶性糖/淀粉含量比值仍然較小，與花蕾期相差不大，這可能與內(nèi)源性GA3和ABA協(xié)同調(diào)控可溶性糖和淀粉含量同步增加有關(guān)。種子萌發(fā)早期桐花樹繁殖體的GA3/ABA含量比值較種子期開始下降，而同期的可溶性糖/淀粉含量比值卻達(dá)到最大值，說明萌發(fā)早期的種子內(nèi)部積累了更多的可溶性糖，高于同期淀粉含量的增加，這不僅可能與內(nèi)源性GA3和ABA共同調(diào)控了α-淀粉酶基因的表達(dá)有關(guān)，也可能與可溶性糖被轉(zhuǎn)運(yùn)至萌發(fā)種子的量有所增加等有關(guān)。可溶性糖為種子早期的萌發(fā)生長提供了充足的能量和結(jié)構(gòu)物質(zhì)。種子萌發(fā)晚期時(shí)桐花樹繁殖體GA3/ABA含量比值降至較低水平，可溶性糖/淀粉含量比值也相應(yīng)降至低水平，推測這是由于萌發(fā)晚期的繁殖體已經(jīng)成熟，內(nèi)源性GA3含量下降，內(nèi)源性ABA含量提高，可溶性糖向貯藏物質(zhì)淀粉的轉(zhuǎn)化增加所致。淀粉含量的增加不僅與胎生種子的形態(tài)建成有關(guān)，也有利于為胎生種子脫離母體后的生長做準(zhǔn)備。

2.4.4 內(nèi)源性激素協(xié)同調(diào)控桐花樹胎生的可能機(jī)制 在植物生長發(fā)育過程中，內(nèi)源性ABA和GA3會(huì)呈現(xiàn)明顯的拮抗作用[12,21]。根據(jù)桐花樹胎生發(fā)育過程中繁殖體的內(nèi)源性ABA和GA3含量及其比值以及可溶性糖和淀粉含量及其比值的動(dòng)態(tài)變化，我們推測：①桐花樹胎生的啟動(dòng)與種子期高水平的GA3和低水平的ABA含量有關(guān)；②GA3和ABA通過拮抗作用協(xié)同調(diào)控了可溶性糖和淀粉含量及其比值的動(dòng)態(tài)變化；③桐花樹胎生進(jìn)程中伴隨著可溶性糖和淀粉含量的提高，前者促進(jìn)了種子胎生早期的細(xì)胞代謝活性，后者保障了種子胎生進(jìn)程中的形態(tài)建成，為胎生種子脫離母體后的生長提供了物質(zhì)儲(chǔ)備與能量供給。

紅樹植物的胎生是一種復(fù)雜而有趣的生物學(xué)現(xiàn)象，與紅樹植物適應(yīng)生境及進(jìn)化密切相關(guān)[1,22-23]，但有關(guān)其分子機(jī)制的研究尚不充分，例如：為什么紅樹植物種子期具有高水平的GA3和低水平的ABA含量？內(nèi)源性ABA和GA3的協(xié)調(diào)作用的靶位點(diǎn)有哪些？調(diào)控方式如何等？這些問題仍有待進(jìn)一步研究。值得一提的是，生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素等其他植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)也可能參與了紅樹植物胎生發(fā)育過程的調(diào)控[1-2,8]，其作用機(jī)制以及相互之間的協(xié)調(diào)關(guān)系也需要進(jìn)一步闡明。

3 結(jié)論

(1)GA3/ABA含量比值變化能明顯地表征桐花樹植物胎生的發(fā)生，同時(shí)，該比值也能反映內(nèi)源性GA3和ABA對(duì)桐花樹植物胎生過程的協(xié)同調(diào)控作用。

(2)桐花樹在種子期有較高水平的可溶性糖含量；進(jìn)入萌發(fā)晚期時(shí)，繁殖體的可溶性糖水平出現(xiàn)大幅度下降，而淀粉含量達(dá)到最高，可能是由于可溶性糖轉(zhuǎn)變成了貯存物質(zhì)淀粉的結(jié)果。

(3)α-淀粉酶可以調(diào)控可溶性糖和淀粉之間的轉(zhuǎn)化，可能是桐花樹繁殖體內(nèi)源性GA3和ABA綜合調(diào)控的靶位點(diǎn)。