沈 捷,陳石泉,吳鐘解,蔡澤富*

(1.海南熱帶海洋學(xué)院 熱帶海洋生物資源利用與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 三亞 572022；2.海南省海洋與漁業(yè)科學(xué)院，海南 海口 571126)

同源異型盒(Homeobox，HB)是一類(lèi)高度保守的轉(zhuǎn)錄因子[1]，因含有同源異型結(jié)構(gòu)域(Homeodomain，HD)而得名，在真核生物個(gè)體發(fā)育及細(xì)胞分化中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。典型的同源異型結(jié)構(gòu)域是由約60個(gè)氨基酸組成，能夠與特異性的DNA序列結(jié)合，它的標(biāo)志就是含有螺旋-環(huán)-螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Helix-loop-helix-turn-helix)的結(jié)構(gòu)和12個(gè)保守的氨基酸(RQLYIVWFNRRK)[2-4]。

WOX(WUSCHEL-related Homeobox)轉(zhuǎn)錄因子家族是HB超家族中的一員，是植物特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子。與典型的同源異型結(jié)構(gòu)域相比，WOX轉(zhuǎn)錄因子家族的同源異型結(jié)構(gòu)域多出了5個(gè)氨基酸[WUSCHEL(WUS)多出6個(gè)氨基酸][4]，對(duì)模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中WOX轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析，可分為3個(gè)進(jìn)化分支：遠(yuǎn)古進(jìn)化支包括WOX10、WOX13、WOX14；WUS進(jìn)化支包含WUS和WOX1-7；而WOX8、WOX9、WOX11和WOX12則是處于兩者之間的中間進(jìn)化支[5]。結(jié)構(gòu)上，WUS進(jìn)化分支的WOX蛋白除了含有典型的HD結(jié)構(gòu)域外，其下游還包括WUS-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域與調(diào)控干細(xì)胞穩(wěn)定性和花器官發(fā)育等過(guò)程密切相關(guān)[6]。一些家族成員在HD和WUS-box之間還存在連續(xù)的酸性氨基酸序列，這段酸性氨基酸序列可能與轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)。一些家族成員如WUS蛋白的羧基端有一個(gè)乙烯響應(yīng)因子(Ethylene Response Factor，ERF)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域，這個(gè)結(jié)構(gòu)域與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。

WOX家族成員眾多，在擬南芥中，WOX家族的15個(gè)成員分別具有調(diào)控干細(xì)胞多能性、側(cè)生器官的發(fā)育、花器官的形成和胚發(fā)育等生物學(xué)功能[5-15]。WOX轉(zhuǎn)錄因子廣泛存在于各種植物之中，水稻全基因組中共有13個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子[16]；玉米全基因組中共預(yù)測(cè)有21個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子[16-17]；在棉花、楊樹(shù)、高粱和茄子等植物中也有關(guān)于WOX基因的報(bào)道[16,18-20]。陸地生物中，WOX基因的鑒定與功能研究非常多，但是相對(duì)于海洋植物而言，目前對(duì)WOX基因的研究還比較少，僅在單細(xì)胞綠藻中發(fā)現(xiàn)WOX基因家族[21]，其他海洋植物并未有報(bào)道。

海草床的生態(tài)功能與服務(wù)價(jià)值重大，作為海岸帶天然生態(tài)屏障，在紅樹(shù)林與珊瑚礁生態(tài)系統(tǒng)之間起著承上啟下的紐帶作用，能促進(jìn)海洋主要元素循環(huán)，凈化水質(zhì)并穩(wěn)固海床，可提供全球每年1.9萬(wàn)億美元的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[21-25]。自1980以來(lái)，全球范圍內(nèi)海草床面積正以110 km2/a的速度減少[22,26-27]，中國(guó)海草床退化也較嚴(yán)重[21,28]。泰來(lái)草(Thalassiahemprichii)是熱帶海草主要優(yōu)勢(shì)種，屬于水鱉科泰來(lái)草屬(Thalassia)，主要分布在東南亞、臺(tái)灣南部和海南的文昌、瓊海、陵水、三亞、三沙等[29]，被列入新加坡瀕危植物紅色名錄“極度瀕?！薄：２葙Y源的保護(hù)與恢復(fù)離不開(kāi)種苗的補(bǔ)充，因此，研究泰來(lái)草重要生理功能的分子調(diào)控機(jī)制對(duì)海草生態(tài)學(xué)、生物地理和遺傳多樣性具有重要意義。本研究通過(guò)篩選泰來(lái)草WOX基因，通過(guò)分析其基因結(jié)構(gòu)與進(jìn)化關(guān)系，探索WOX基因在泰來(lái)草中潛在的生理功能和根莖發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制，為深入利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行種苗繁育調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源

用于泰來(lái)草WOX基因篩選的數(shù)據(jù)來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室對(duì)泰來(lái)草轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果，樣品采集自海南陵水新村港與黎安港海草特別保護(hù)區(qū)，為結(jié)構(gòu)完整、生長(zhǎng)健壯的泰來(lái)草葉片。利用BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)，共獲得了6.47 GB的數(shù)據(jù)，通過(guò)denove組裝，并利用KEGG、Gene Oncology(GO)、NR、NT、SwissProt、Protein families(Pfam)、EuKaryotic Orthologous Groups(KOG)7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行注釋?zhuān)@得了32 097個(gè)Unigenes(該成果論文另行發(fā)表，GeneBank登錄號(hào)：SRR10438616)。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用ORF finder預(yù)測(cè)泰來(lái)草WOX基因CDS(Coding DNA Sequence)；利用在線軟件SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；利用EXPASY(https://web.expasy.org/protparam/)對(duì)蛋白的分子量、等電點(diǎn)等進(jìn)行預(yù)測(cè)；利用泰來(lái)草的WOX基因序列在數(shù)據(jù)庫(kù)(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)中進(jìn)行檢索和同源性對(duì)比；利用Clustal W軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進(jìn)行蛋白序列的多重聯(lián)配分析；利用MEGA X軟件(http://www.megasoftware.net/)的最大似然法(Maximum Likelihood, ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[Bootstrap：1 000, Substitution Model: Jones-Taylor-Thormton(JTT)Modle, Tree Inferebce Options: Nearest-Neighbor-Interchange(NNI)]。

2 結(jié)果與討論

2.1 泰來(lái)草WOX基因的獲得與結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)泰來(lái)草轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果，僅發(fā)現(xiàn)一個(gè)WUSCHEL同源基因，該基因長(zhǎng)834 bp，通過(guò)ORF Finder預(yù)測(cè)獲得了一個(gè)597 bp的全長(zhǎng)CDS序列，編碼198個(gè)氨基酸，分子量為21 967.43，pI值為5.34，信號(hào)肽分析表明，N端包含29個(gè)氨基酸的信號(hào)肽[MHPAVFLSLPDLRCSLLLLVTWVFTPVTT，http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，圖1(a)]。

利用SMART軟件分析蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示包含典型的Homeobox結(jié)構(gòu)域(29—97)，對(duì)其全長(zhǎng)CDS序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果表明這個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域是參與發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控的DNA結(jié)合因子[圖1(b)]。

圖1 泰來(lái)草WOX轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)分析

利用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)同源建模的方法對(duì)其進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示，本地建模質(zhì)量評(píng)估(Local Quality Estimate)值為0.3～0.8[圖2(a)]，全局模型質(zhì)量評(píng)估(GMQE)值為0.19，定性模型質(zhì)量分析(QMEAN)值為-1.00[(圖2(b)]，HOX domain建模同源性為30.77%，結(jié)果比較可靠。從結(jié)果可以看出，該蛋白具有Helix-loop-helix-turn-helix結(jié)構(gòu)[圖2(c)]，這與其他植物中WOX基因的三維建模結(jié)果一致。

圖2 泰來(lái)草WOX轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)建模分析

2.2 同源比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)分析

將泰來(lái)草的WOX基因序列與NCBI的數(shù)據(jù)庫(kù)中已公布的其他物種的WOX基因進(jìn)行blast比對(duì)，獲得了99條相似序列，其中一致性最高為67.39%，最低為38.50%，其相似結(jié)果主要集中在豆科植物中，僅發(fā)現(xiàn)一種水生植物——蓮(Nelumbonucifera)的WOX基因，此外還有葫蘆科、錦葵科、棕櫚科以及蝶形花科和一些藤本植物。從中篩選了序列一致性最高的8條序列進(jìn)行蛋白的多重聯(lián)配分析(圖3)。結(jié)果顯示，在這8種植物中，均具有明顯的Homeobox結(jié)構(gòu)域，但是泰來(lái)草與這些植物相比，N-端明顯的缺失了一段，這可能與陸地植物和海洋植物的進(jìn)化關(guān)系有關(guān)。

圖3 泰來(lái)草WOX轉(zhuǎn)錄因子與其他8種植物的WOX8轉(zhuǎn)錄因子的多重聯(lián)配分析

對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中所能獲得的植物WOX蛋白序列進(jìn)行篩選，選擇了93條處于中間進(jìn)化支的典型序列(表1)，與泰來(lái)草的WOX蛋白序列進(jìn)行對(duì)比分析，并利用MEGA X中的最大似然法(ML)構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。從結(jié)果可以看出，雖然WOX8和WOX13在序列上具有很大的相似性，但泰來(lái)草的WOX轉(zhuǎn)錄因子與其他物種的WOX8聚集在一起，故將本研究中獲得的泰來(lái)草WOX基因注釋為T(mén)halassiatestudinumWUSCHEL-relatedHomeobox8(ThWOX8)。有意思的是，泰來(lái)草與陸地棉和海島棉的WOX蛋白聚集在一個(gè)分支之上，并且與其他的豆科等物種具有顯著的分離。

圖4 泰來(lái)草WOX基因蛋白與其他93種植物WOX基因蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

表1 用于進(jìn)化樹(shù)分析的93條蛋白序列信息

2.3 討論

WOX轉(zhuǎn)錄因子幾乎存在于植物的每一個(gè)器官之中，在各器官分裂旺盛的細(xì)胞群中顯著表達(dá)，參與調(diào)控植物干細(xì)胞的穩(wěn)定、器官形成、胚的形成關(guān)鍵發(fā)育等過(guò)程。為了長(zhǎng)期維持植物細(xì)胞自我更新和分化之間的平衡，需要將動(dòng)態(tài)信號(hào)轉(zhuǎn)換為空間和時(shí)間上精確且穩(wěn)定的基因表達(dá)狀態(tài)，WOX轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)變應(yīng)性控制生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)和響應(yīng)途徑，調(diào)節(jié)靶基因座的組蛋白乙?；鹱饔?，觸發(fā)植物生長(zhǎng)素的局部分化，同時(shí)維持干細(xì)胞在整個(gè)生命周期中的生存，以保持植物全周期狀態(tài)下的生長(zhǎng)和發(fā)育[30]。

本研究根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果，通過(guò)對(duì)7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選僅獲得了1個(gè)WOX基因，這可能是用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的樣品根莖葉結(jié)構(gòu)不完整造成的。序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建結(jié)果存在差異，這可能是由于不同算法造成的。結(jié)合前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果綜合考慮，我們認(rèn)為泰來(lái)草與豆科和蓮科的親緣關(guān)系較為接近。這是海洋植物泰來(lái)草中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)WOX轉(zhuǎn)錄因子，由于缺乏其它海洋高等植物的WOX8的同源基因，我們尚不清楚其他海洋植物是否具有同樣的類(lèi)似基因。

從單細(xì)胞綠藻到綠色開(kāi)花植物，親緣關(guān)系相差巨大，但都含有WOX基因，說(shuō)明這是一類(lèi)較為古老的基因。基因家族數(shù)量的擴(kuò)增往往在進(jìn)化發(fā)育過(guò)程中起著重要的作用，包括新結(jié)構(gòu)起源、形態(tài)的多樣化以及復(fù)制后新功能的產(chǎn)生和亞功能的分化[31-33]。系統(tǒng)進(jìn)化研究的結(jié)果也表明，在單細(xì)胞綠藻和陸地植物發(fā)生分化之前，他們的共同祖先就已經(jīng)含有至少一個(gè)遠(yuǎn)古支起源的WOX基因，隨后各物種的遠(yuǎn)古支WOX基因獨(dú)立進(jìn)化，進(jìn)而擴(kuò)增分化出中間支和WUS支[34]。我們?cè)谔﹣?lái)草中發(fā)現(xiàn)的ThWOX8是屬于中間支的一個(gè)重要基因。在擬南芥中，AtWOX8在胚胎基部區(qū)域表達(dá)，與WUS支的WOX2基因協(xié)同作用，參與調(diào)控?cái)M南芥受精卵發(fā)育成胚的過(guò)程，促進(jìn)胚根發(fā)育形成根分生組織[7,14,35]。此外在胚發(fā)育過(guò)程中，STPL/WOX8通過(guò)調(diào)控CUPSHAPEDCOTYLEDON(CUC)基因的表達(dá)促進(jìn)子葉葉緣的發(fā)育[36]。水稻DWT1是擬南芥AtWOX8/9的同源基因，具有影響水稻節(jié)間細(xì)胞分生和伸長(zhǎng)的作用，同時(shí)調(diào)控水稻主桿和分蘗生長(zhǎng)的一致性[37]。在裸子植物挪威云杉(Piceaabies)中，PaWOX2和PaWOX8/9在受精卵和體胚發(fā)育早期高度表達(dá)[38]，表明這一機(jī)制在被子植物和裸子植物中具有保守性[39]。這些研究結(jié)果表明，WOX8參與了體細(xì)胞胚特別是基部(根端)的發(fā)育，為我們進(jìn)一步分析ThWOX8基因在泰來(lái)草根發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮的作用及其調(diào)控機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

海草作為一種重要的潮間帶植物，是重要的海洋初級(jí)生產(chǎn)者，能夠?yàn)橐恍┖Ｑ笊锾峁┴S富的食物和棲息場(chǎng)所，同時(shí)對(duì)維持近海生態(tài)平衡具有至關(guān)重要的作用。近年來(lái)海草種群的衰退現(xiàn)象嚴(yán)重，對(duì)海草床的生態(tài)修復(fù)成為研究熱點(diǎn)。但生境恢復(fù)法、種子法、移植法等海草床修復(fù)方法都不夠理想[40-42]，缺乏組織培養(yǎng)等有效手段進(jìn)行大量的人工繁育。目前，我們正在進(jìn)行ThWOX8基因過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)化擬南芥的實(shí)驗(yàn)，旨在深入分析ThWOX8基因在泰來(lái)草發(fā)育過(guò)程中所發(fā)揮的作用。了解泰來(lái)草的分子生物學(xué)特性、基因表達(dá)信息，進(jìn)一步挖掘與根莖葉生長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵基因，尤其是與體細(xì)胞胚胎發(fā)生、定殖相關(guān)的基因及其分子機(jī)理，可以為泰來(lái)草分子育種與擴(kuò)繁提供有益的思路。

3 結(jié)論

本研究利用泰來(lái)草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到一個(gè)WOX基因(命名為T(mén)hWOX8)，該基因全長(zhǎng)597 bp，編碼198個(gè)氨基酸，其中具有典型的Homeobox結(jié)構(gòu)域。同源比較分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明：泰來(lái)草ThWOX8與豆科植物和蓮的親緣關(guān)系較為接近。關(guān)于ThWOX8在調(diào)控泰來(lái)草胚胎發(fā)育過(guò)程中的具體生理功能及機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。