李樹(shù)杰，宋昱

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院ICU，天津300457）

急性心肌梗死是我國(guó)50～75歲人群中多發(fā)疾病， 而且死亡率居高不下[1]。急性心肌梗死主要是由持續(xù)性缺血缺氧、冠狀動(dòng)脈急性缺血缺氧所導(dǎo)致的心肌梗死。目前臨床主要采取保守治療和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneouscoronary intervention，PCI）[2]。心力衰竭是急性心肌梗死后常見(jiàn)的并發(fā)癥，并且與多種嚴(yán)重的不良預(yù)后密切相關(guān)[3-4]。然而，目前針對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭的發(fā)病機(jī)制尚不明了。其特異性預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物和候選治療靶點(diǎn)尚未完全建立。針對(duì)于此，本研究利用GEO數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行急性心肌梗死后心力衰竭靶點(diǎn)基因的篩選，并開(kāi)展臨床初步驗(yàn)證。

1 資料與方法

1.1 生物信息方法篩選差異基因

1.1.1 數(shù)據(jù)源 本研究分析數(shù)據(jù)來(lái)源于GEO數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），編號(hào)GSE59867。芯片中包含65個(gè)樣本，記錄了17例急性心肌梗死患者在發(fā)病后6個(gè)月隨訪期間內(nèi)心力衰竭發(fā)展的詳細(xì)情況。本研究生物信息部分針對(duì)芯片中17例急性心肌梗死患者入院、出院（4～6 d）、1個(gè)月和6個(gè)月后外周血單個(gè)核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行分析。芯片中急性心肌梗死發(fā)生后心力衰竭患者（n=9）與非心力衰竭患者（n=8）在臨床基本特征上無(wú)顯著差異（P>0.05）。芯片數(shù)據(jù)是利用GPL6244平臺(tái)進(jìn)行分析。

1.1.2 差異基因分析 本研究以R語(yǔ)言中l(wèi)imma軟件包來(lái)分析不同組之間差異表達(dá)的mRNA和miRNA，以對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的差異表達(dá)倍數(shù)（Log2FC）的絕對(duì)值>1和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.1.3 miRNA靶點(diǎn)基因的預(yù)測(cè) miRNA的靶點(diǎn)基因通過(guò)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)（miRDB，版本6.0）進(jìn)行預(yù)測(cè)[6]。Cytoscape軟件（3.7.2版）用于miRNA-mRNA相關(guān)性可視化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)建立。

1.2 針對(duì)重點(diǎn)基因的臨床驗(yàn)證

1.2.1 研究對(duì)象 回顧性分析天津泰達(dá)國(guó)際心血管病醫(yī)院2018年1月—2020年12月經(jīng)病理確診的急性心肌梗死患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病例均經(jīng)病理證實(shí)；有完整的影像學(xué)檢查資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在其他心血管疾病；存在重大疾??；未得到患者或者家屬同意?；颊叱鲈汉蟾櫽涗浻^察6個(gè)月，研究對(duì)象共61例，根據(jù)心力衰竭與否分為：心力衰竭組[共32例，男性20例，女性12例，年齡（51.2±8.3）歲]與非心力衰竭組[共29例，男性18例，女性11例，年齡（47.3±7.2）歲]。組間患者臨床基本特征上無(wú)顯著差異（P>0.05）。

1.2.2 ELISA檢測(cè) 差異基因濃度測(cè)定采用ELISA雙抗體夾心法，具體操作嚴(yán)格按照商用試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行（Abcam公司）。待測(cè)樣品源于兩組患者的外周血。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次獨(dú)立檢測(cè)，最終進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel 2013軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)，SAS 9.4和SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)連續(xù)性變量進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的變量以±s表示，采用SAS 9.4中的t檢驗(yàn)方法用于數(shù)據(jù)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芯片中心力衰竭組差異基因篩選與非心力衰竭組比較 心力衰竭組共顯示703個(gè)差異表達(dá)基因（mRNAs），包括567個(gè)上調(diào)基因和136個(gè)下調(diào)基因（圖1A和圖1B）。其中SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG表現(xiàn)出最顯著上調(diào)。與此同時(shí)，心力衰竭組患者表現(xiàn)出12個(gè)差異miRNAs，其中上調(diào)的miRNAs 5個(gè)，下調(diào)的miRNAs 7個(gè)（圖1C和圖1D）。miR-133、miR-124-3和miR-9-1顯著下調(diào)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 急性心肌梗死患者心力衰竭組差異基因分析Fig 1 Differential geneanalysisof heart failuregroup in patientswith acutemyocardial infarction

2.2 芯片中心力衰竭組miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 本研究利用Cytoscape軟件將3種選定的miRNA（miR-133、miR-124-3和miR-9-1）和5個(gè)差異最為顯著的mRNA（SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG）構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。從圖2可以看出，miR-133參與SPI1和MCUR1功能的調(diào)控，而miR-124-3和miR-9-1分別控制ZBTB7A、PPARG以及IRF8。

圖2 急性心肌梗死患者心力衰竭組mRNA-miRNA基因網(wǎng)絡(luò)圖Fig 2 Construction of mRNA-miRNA interaction network of heart failuregroup in patientswith acutemyocardial infarction

2.3 差異基因臨床檢測(cè) 與非心力衰竭組比較，SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG蛋白表達(dá)濃度在心力衰竭組中顯著升高。與差異基因篩選結(jié)果一 致，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 差異基因的水平檢測(cè)（±s）Tab 1 Detection of differentially expressed genes（±s）

表1 差異基因的水平檢測(cè)（±s）Tab 1 Detection of differentially expressed genes（±s）

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3 討論

急性心肌梗死是臨床常見(jiàn)危重癥，起病急驟，病情變化迅速，死亡率高。心力衰竭是急性心肌梗死最常見(jiàn)的并發(fā)癥。近年來(lái)，中國(guó)發(fā)布了心肌梗死和心力衰竭的診療指南[7]。指南中明確指出：中國(guó)心肌梗死后心力衰竭仍然存在很高的發(fā)病率。雖然近些年隨著治療手段的發(fā)展，心肌梗死后心力衰竭患者的預(yù)后得到一定改善，但是其死亡率、心血管事件發(fā)生率仍然居高不下。這與該類患者治療手段和發(fā)現(xiàn)的時(shí)間密切相關(guān)[8]。目前臨床上針對(duì)急性心肌梗死后心力衰竭的有效標(biāo)記物研究較少。本研究利用生物信息學(xué)和臨床驗(yàn)證的方式，提出了若干潛在心力衰竭標(biāo)志物，并構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究確定SPI1、MCUR1、ZBTB7A、IRF8和PPARG可以作為急性心肌梗死后心力衰竭的主要特征性基因。最近一項(xiàng)研究表明，SPI1在心肌重塑的發(fā)病機(jī)制中存在明顯的過(guò)量表達(dá)[9]。MCUR1是線粒體鈣單向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)因子1，主要在心肌細(xì)胞內(nèi)離子調(diào)控方面發(fā)揮重要作用[10]。ZBTB7A是一種含POZ結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，直接結(jié)合到許多基因組調(diào)控位點(diǎn)，控制染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因組啟動(dòng)子的招募。ZBTB7A主要通過(guò)核因子-κB通路，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的功能[11]。IRF8是來(lái)自干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族的一員。除了調(diào)節(jié)先天性免疫反應(yīng)外，IRF8還被證實(shí)涉及某些癌癥的腫瘤抑制基因調(diào)節(jié)。IRF8心肌特異性過(guò)表達(dá)的小鼠可以對(duì)主動(dòng)脈縮窄引起的心肌肥大具有保護(hù)作用[12]。PPARG是核受體的過(guò)氧化物酶體的亞家族成員之。目前，PPARG已經(jīng)證實(shí)與許多疾病的形成密切相關(guān)，例如肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化和癌癥。PPARG還可以通過(guò)抑制炎癥、氧化應(yīng)激和凋亡發(fā)揮心臟保護(hù)作用[13]。

本研究另一個(gè)重點(diǎn)是miRNA和急性心肌梗死后心力衰竭的密切聯(lián)系。miR-133、miR-124-3和miR-9-1是心力衰竭組的主要差異miRNAs。miR-133在之前的研究中已經(jīng)被證明可以控制心肌纖維類型轉(zhuǎn)換并誘導(dǎo)肌源性分化程序[14]。miR-124-3和miR-9-1也在一項(xiàng)生物信息報(bào)道中列為心力衰竭的主要參與mRNAs[15]。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)的5個(gè)主要差異基因在心力衰竭組中的表達(dá)均明顯增加。這或許可以用3個(gè)主要miRNAs的下調(diào)來(lái)解釋（圖2）。這些都值得進(jìn)一步調(diào)查。總體而言，本研究全面比較了急性心肌梗死后心力衰竭組與非心力衰竭組主要的差異基因圖譜，并建立了差異基因網(wǎng)絡(luò)圖，為今后了解急性心肌梗死患者后心力衰竭的發(fā)病機(jī)制提出了新的思路。本研究為單中心研究，樣本量有限，尚存在一定的局限性。為了差異標(biāo)志物更有效的進(jìn)行臨床推廣，未來(lái)還需要進(jìn)行多中心、大樣本量研究。