謝松波，胡 卓，呂 揚(yáng)，陳華文

（1.監(jiān)利市人民醫(yī)院，湖北 監(jiān)利 433300；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

重癥急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）屬于臨床上常見的急腹癥，其臨床表現(xiàn)病情危重、發(fā)病進(jìn)展快、死亡率高，這是由于炎癥因子的過度釋放導(dǎo)致腸黏膜損傷，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征，從而加劇病情[1-3]。因此，控制或者減輕重癥胰腺炎病情具有重要的臨床價(jià)值。西紅花苷（Crocin），又稱為藏紅花素，是西紅花（藏紅花）的主要活性成分，具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血脂、降血壓等作用[4-5]。研究表明西紅花苷對(duì)腦、心肌等組織的損傷具有一定的保護(hù)作用[6-7]。本研究將通過建立SAP大鼠模型并給予西紅花苷治療，通過檢測相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)一步探討西紅花苷對(duì)重癥胰腺炎引起的胰腺組織損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡SPF級(jí)健康雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量190~220 g，由北京安凱毅博生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號(hào)：SCXK（京）2017-0006。飼養(yǎng)于溫度26~28℃、濕度50%~60%的適宜條件下，光照/黑暗時(shí)間為12 h/12 h，使用無菌水和飼料飼養(yǎng)1周后進(jìn)行造模處理。實(shí)驗(yàn)經(jīng)監(jiān)利市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：20181106X。

1.2 藥物與試劑 西紅花苷（南通飛宇生物科技有限公司，貨號(hào)：FY1698）；牛黃膽酸鈉（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：T8510）；大鼠淀粉酶（amylase，AMS）ELISA試劑盒（江蘇江萊生物科技有限公司，貨號(hào)：JL20962）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（貨號(hào)：PT516）；大鼠白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（貨號(hào)：PI303）；大鼠白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（貨號(hào)：PI328）；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（紅色熒光）（貨號(hào)：C1089）；蘇木精-伊紅（Hematoxylin-eosin，HE）（貨號(hào)：C0105）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Bcl2相關(guān)X蛋白（Bcl2 associated X protren，Bax）兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab32503）；Janus蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab108596）；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）兔單克隆抗體（貨號(hào)：ab68153）；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）兔多克隆抗體（貨號(hào)：ab8226）；山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號(hào)：ab205718）[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]；PrimeScriptTMRT reagent Kit（貨號(hào)：RR037A）、Premix Ex TaqTM（貨號(hào)：RR390A）[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]；裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved Cystein aspartic protease 3，cleaved-Caspase-3）兔單克隆抗體（貨號(hào)：9661S）；p-JAK2兔單克隆抗體（貨號(hào)：3771S）；p-STAT3兔單克隆抗體（貨號(hào)：9145S）（上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司）。

1.3 主要儀器7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；DM1000 LED正置顯微鏡、DM2000熒光顯微鏡（德國Leica公司）；Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；CL-1000i全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；Microfuge 20高速冷凍離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.4 造模與分組 將32只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、西紅花苷低劑量組、西紅花苷高劑量組，每組8只。模型組和西紅花苷低、高劑量組大鼠采用向膽胰管內(nèi)注射5%牛黃膽酸鈉建立SAP大鼠模型[8]。采用異氟烷吸入式麻醉大鼠，經(jīng)腹正中切口進(jìn)入腹腔，找到十二指腸和膽胰管并用血管夾夾閉，逆行膽管勻速注射5%牛黃膽酸鈉（0.011 mL/100 g）。注射后5~10 min肉眼觀察胰腺組織水腫、胰膽管周圍組織出現(xiàn)磚紅色改變，即建模成功。去除血管夾，關(guān)腹。假手術(shù)組大鼠僅開腹，翻動(dòng)十二指腸和胰腺數(shù)次后關(guān)腹。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 給藥前，西紅花苷加入生理鹽水溶解，制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的藥液并進(jìn)行分裝保存?zhèn)溆?。造模成功后，西紅花苷低劑量組大鼠尾靜脈注射25 mg/kg西紅花苷溶液，西紅花苷高劑量組大鼠尾靜脈注射50 mg/kg西紅花苷溶液[9]，模型組和假手術(shù)組大鼠靜脈注射等量的生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射1周。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 ELISA法檢測大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6含量 所有大鼠在治療后，抽取腹主動(dòng)脈血4 mL，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清。按照大鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA檢測試劑盒的使用說明書測定樣品的吸光度值，計(jì)算含量。

1.6.2 HE染色檢測大鼠胰腺組織病理形態(tài)學(xué)改變 頸椎脫臼法處死各組大鼠，取大鼠胰腺組織制成標(biāo)本（0.5cm×0.5cm），使用4%甲醛溶液進(jìn)行固定，然后進(jìn)行石蠟包埋、脫水并制成切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠胰腺組織病理變化。

1.6.3 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將制備的切片進(jìn)行脫蠟處理，滴加20 μg/mL蛋白酶K，37℃孵育30 min，用1×PBS溶液洗滌3次。然后滴加50 μL TUNEL檢測混合液（5 μL TdT酶+45 μL熒光標(biāo)記液），37℃避光孵育60 min，1×PBS溶液洗滌3次。用抗熒光淬滅封片液封片后在熒光顯微鏡下觀察。1.6.4 RT-qPCR檢測JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)水平取大鼠的胰腺組織，使用Trizol法提取組織中的總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)水平。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性30 s，40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)（94℃5 s，60℃20 s）。以β-actin為內(nèi)參，采用公式（2-△△Ct）計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列

1.6.5 Western blotting檢 測Bax、cleaved-Caspase-3、JAK、p-JAK、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取大鼠胰腺組織中總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳（80 V 30 min，100 V 90 min）、轉(zhuǎn)膜（100 V，100 min），再使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入一抗（1∶1 000）4℃過夜孵育。加入二抗（1∶3 000），室溫孵育2 h。通過ECL化學(xué)發(fā)光法并使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀來分析蛋白條帶。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用（±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血清學(xué)指標(biāo)的檢測比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均不同程度下降（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量降低（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清炎癥因子及淀粉酶含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清炎癥因子及淀粉酶含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

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2.2 各組大鼠胰腺組織病理變化情況 假手術(shù)組大鼠胰腺組織無炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫等病理性改變；模型組大鼠胰腺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫及組織壞死；西紅花苷低劑量組大鼠胰腺組織組炎癥細(xì)胞浸潤和水腫情況較模型組略有改善；西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，水腫以及組織壞死得到顯著改善。（見圖1）

圖1 各組大鼠胰腺組織病理變化比較（HE，×100）

2.3 各組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量均不同程度下降（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡率，Bax、cleaved-Caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05）。（見圖2、表3）表3各組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡水平及相關(guān)蛋白表達(dá)比較（±s）

圖2 各組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)情況

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

2.4各組大鼠JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）；與西紅花苷低劑量組比較，西紅花苷高劑量組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P＜0.05）。（見圖3~4、表4）

圖3 各組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 （±s，n=8）

表4 各組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

表4 各組大鼠胰腺組織JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西紅花苷低劑量組比較，cP＜0.05

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3 討 論

重癥急性胰腺炎是臨床上常見的急腹癥，除帶來局部的病理損傷外，還伴隨著強(qiáng)烈的全身炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，甚至?xí)鹑矶嗥鞴偎ソ?，乃至死亡的發(fā)生[10]。重癥胰腺炎的治療方法常包括胃腸減壓、抑制胰腺外分泌、抑制胰酶活性、預(yù)防性抗生素使用等，但其治療存在一定的局限性，例如治療周期長，臨床療效差，并發(fā)癥多等[11]，因此尋找有效的重癥胰腺炎治療藥物具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。

西紅花苷具有多重生物學(xué)活性。ZAGHOULM S等[12]研究表明西紅花苷對(duì)博來霉素（bleomycin，BLM）誘導(dǎo)的肺纖維化具有明顯的抗氧化、抗炎及抗纖維化作用。LI X等[13]研究表明西紅花苷能夠通過抑制細(xì)胞因子表達(dá)來減少類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）的炎癥反應(yīng)。本研究建立了重癥胰腺炎SD大鼠模型并采用西紅花苷進(jìn)行治療，HE染色結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤、間質(zhì)水腫以及組織壞死，西紅花苷干預(yù)后，大鼠胰腺組織炎癥細(xì)胞浸潤顯著減少，水腫及組織壞死得到改善。提示西紅花苷能夠減輕重癥胰腺炎的炎癥反應(yīng)，改善胰臟組織損傷。

TNF-α、IL-1β、IL-6在炎癥反應(yīng)引起的重癥胰腺炎的發(fā)病中起著重要的作用，TNF-α能夠介導(dǎo)多種炎癥因子（IL-1β、IL-6等）的釋放，促進(jìn)白細(xì)胞的趨化反應(yīng)和黏附，進(jìn)而損傷胰腺組織[14]。IL-1β是促炎性細(xì)胞因子，在重癥胰腺炎中參與胰腺組織的破壞和水腫形成[15]。IL-6是一類非特異性炎癥因子，參與全身性炎癥反應(yīng)，在機(jī)體的抗免疫反應(yīng)中起到重要的作用[16]。本研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量顯著升高；與模型組比較，西紅花苷高、低劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及淀粉酶含量均存在不同程度下降。這提示西紅花苷通過抑制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而降低胰腺組織的炎癥水平。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡率，以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、cleaved-Caspase-3表達(dá)水平顯著升高；西紅花苷干預(yù)后，大鼠胰腺組織細(xì)胞凋亡率，以及Bax、cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著下降。提示西紅花苷通過降低細(xì)胞凋亡率發(fā)揮對(duì)重癥胰腺炎的保護(hù)作用。

JAK2/STAT3信號(hào)通路是一個(gè)將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)的二級(jí)聯(lián)信號(hào)，跨膜受體活化后將信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、細(xì)胞免疫等過程[17]。LI M等[18]研究表明JAK2抑制劑AG490處理后會(huì)降低大鼠促炎性細(xì)胞因子的活性，并顯著減輕胰腺炎相關(guān)的肝損傷。GAO H Y等[19]結(jié)果顯示在2型糖尿病大鼠模型中二甲雙胍能夠在高血糖培養(yǎng)條件下激活JAK2/STAT3途徑并減輕細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠胰腺組織JAK2 mRNA、STAT3 mRNA表達(dá)，以及JAK2、STAT3、p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)均升高；西紅花苷干預(yù)后，JAK2/STAT3信號(hào)通路相關(guān)指標(biāo)表達(dá)水平均顯著下降。這提示西紅花苷可能通過抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路激活發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，西紅花苷能夠抑制重癥胰腺炎大鼠炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡，對(duì)重癥胰腺炎大鼠起到保護(hù)作用，其機(jī)制可能與西紅花苷抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本研究為臨床治療重癥胰腺炎提供了新的思路。