王 雙，王婷婷，田俊娜，張 蕻，施懷生，趙思俊，樸晉華

（1.山西中醫(yī)藥大學，山西 晉中 030619；2.山西省食品藥品檢驗所，山西 太原 030001）

學習記憶障礙是一種臨床常見病癥，其發(fā)病機制十分復雜，不僅影響了人們的工作和生活，嚴重者還會誘發(fā)其他疾病。近年來，中醫(yī)藥在改善學習記憶障礙方面越來越受到研究者們的關注[1]。

益智方是在經典名方六味地黃丸的基礎上經化裁重組而得，方中熟地黃質潤入腎，填精益髓，滋補陰精，養(yǎng)血補虛，為君藥；山茱萸、山藥為臣藥，山茱萸可補養(yǎng)肝腎，并且能夠攝精，山藥雙補脾腎，此三味藥既能夠補腎固精又可以補脾來助后天生化之源；遠志具有安神益智的功效，可治驚悸、健忘、失眠，《神農本草經》有言，其“補不足，除邪氣，利九竅，益智慧，耳聰目明，不忘，強志倍力。”益智仁健脾補腎，與上四味藥合用，共奏補腎固精之功。本方以補為主，具有填精益髓、養(yǎng)血補虛、安神益智的功效?，F代研究表明熟地黃[2]、山茱萸[3]、山藥[4]、遠志[5]及益智仁[6]等中藥對學習記憶障礙具有明顯的改善作用。

本實驗以東莨菪堿致記憶障礙小鼠為動物模型，分別通過跳臺實驗、避暗實驗及Morris水迷宮實驗等行為學指標，考察益智方改善學習記憶障礙的藥理作用及其機制，為進一步臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種SPF級雄性小鼠60只，體質量18～20 g，購于北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證編號：SCXK（京）2019-0010。小鼠在山西省食品藥品檢驗所屏障環(huán)境飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度24～26℃，相對濕度45%～55%，期間自由進食和進水。實驗期間小鼠健康狀況良好，實驗結束后小鼠采用CO2安樂死，實驗經山西省食品藥品檢驗所實驗動物倫理委員會審查并批準實施。

1.2 藥物與試劑 益智方，生藥臨床擬用量為14 g/d，將熟地黃、山茱萸、山藥、遠志和益智仁除去雜質后，取處方量浸泡，加入10倍于藥材質量的水煎煮2次，每次煎煮1 h，過濾，合并濾液并離心，濃縮藥液到所需濃度；按體表面積計算，20 g小鼠相當60 kg成人用量的0.003倍，小鼠的生藥等效劑量為14 g×0.003/0.02（kg）=2 g/kg。以等效劑量作為低劑量，中、高劑量分別為低劑量的2、4倍。東莨菪堿（鄭州賽科藥業(yè)科技有限公司，批號：20190316）；乙酰膽堿（ACh）ELISA試劑盒（批號：202008）、膽堿乙酰酯酶（AchE）ELISA試劑盒（批號：202008）、膽堿乙酰轉移酶（ChAT）ELISA試劑盒（批號：202008）[盈芯生物科技（上海）有限公司]。

1.3 主要儀器SDT-8跳臺實驗視頻分析系統、PAT-8避暗實驗視頻分析系統、WMT-100 Morris水迷宮視頻分析系統（成都泰盟軟件有限公司）；T-2000電子天平（美國雙杰兄弟集團有限公司）。

1.4 造模與給藥 將60只小鼠隨機分為空白組、模型組、益智方低劑量組、益智方中劑量組、益智方高劑量組，每組12只。益智方低、中、高劑量組小鼠灌胃給予益智方溶液，生藥劑量分別為2、4、8 g/kg；空白組和模型組小鼠灌胃給予等體積純化水，灌胃體積10 mL/kg，1次/d，連續(xù)30 d。給藥30 d結束后進行行為學測試。行為學測試期間持續(xù)給藥，在每項實驗前30 min，除空白組外，其余各組小鼠分別腹腔注射東莨菪堿（5 mg/kg）制備學習記憶障礙模型，空白組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水[7]。據行為學相應的測試指標（跳臺實驗、避暗實驗的潛伏期、錯誤次數，以及Morris水迷宮的逃避潛伏期、逃逸平臺滯留時間和有效進入次數），模型組與空白組比較，差異有統計學意義（P<0.05），說明造模成功。

1.5 觀察指標

1.5.1 跳臺實驗[8]持續(xù)給藥第31天，將小鼠放入反應箱內先適應環(huán)境3 min，然后再將小鼠放置反應箱內的銅柵上，立即通以36 V的交流電，如此訓練5 min。24 h后為測試階段。記錄小鼠第一次跳下高站臺的時間即為跳臺潛伏期時間，3 min內受到電擊的次數即錯誤次數。

1.5.2 避暗實驗[9]持續(xù)給藥第33天，先將各組小鼠放入避暗箱（黑色長方形避暗箱分明暗兩室，暗室箱底通有電流）的明室中，不通電的情況下自由活動3 min；再將小鼠趕到暗室通電，每只訓練5 min，在間隔24 h后正式實驗時將小鼠面部背向洞口放入明室，拉開隔板，并同時啟動計時器，小鼠第一次到達暗室的時間即為潛伏期；進入暗室受到電擊的次數即錯誤次數。記錄每只小鼠的潛伏期和5 min內小鼠進入暗箱的錯誤次數。

1.5.3 Morris水迷宮實驗[10]Morris水迷宮由直徑150 cm、高70 cm的圓形水池組成，池中等分劃為4個象限，水中加入鈦白粉使其渾濁，水面高于平臺表面1～2 cm，水溫控制在（24.0±0.5）℃，采用圖像采集系統記錄小鼠的逃避潛伏期、逃逸平臺滯留時間、有效區(qū)域進入次數等。（1）定位航行實驗：持續(xù)給藥第35天，在水池中第Ⅱ象限的中心位置放置平臺，每天依次在每個象限訓練每只小鼠，若小鼠60 s內未能找到平臺，則將小鼠引導至平臺上，其潛伏期為60 s，無論小鼠60 s內是否能找到平臺，均讓其在平臺停留15 s，并記錄小鼠入水至找到平臺的時間，即逃避潛伏期。（2）空間探索實驗：在末次定位航行試驗結束24 h后進行1次空間探索實驗，先撤走平臺，隨后將小鼠面向池壁放入水中，入水口選擇平臺對面的Ⅳ象限，時間為60 s，記錄小鼠穿越原平臺位置的次數和原平臺象限游泳區(qū)域進入次數作為檢測指標來反映空間記憶能力。

1.5.4 腦組織中相關指標檢測 行為學實驗結束后，將小鼠迅速斷頭取腦，并凍存于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。測定前，精確稱量小鼠腦組織質量，加入9倍量的生理鹽水制成10%組織勻漿液，待測；4℃、3 000 r/min下離心20 min，然后取上清液，按照試劑盒說明書的方法步驟檢測ACh、AchE、ChAT的含量。

1.6 統計學方法 實驗數據均采用SPSS 23.0統計軟件進行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠跳臺潛伏期和錯誤次數比較 與空白組比較，模型組小鼠跳臺潛伏期顯著縮短（P<0.01），錯誤次數顯著增加（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠跳臺潛伏期均顯著延長（P<0.05或P<0.01），錯誤次數均顯著減少（P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙。（見圖1）

圖1 各組小鼠跳臺潛伏期和錯誤次數比較（±s，n=12）

2.2 各組小鼠避暗潛伏期和錯誤次數比較 與空白組比較，模型組小鼠避暗潛伏期顯著縮短（P<0.01），錯誤次數顯著增加（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠小鼠避暗潛伏期明顯延長（P<0.01或P<0.05），錯誤次數顯著減少（P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙。（見圖2）

圖2 各組小鼠避暗潛伏期和錯誤次數比較（±s，n=12）

2.3 各組小鼠Morris水迷宮實驗結果

2.3.1 各組小鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較 定位航行實驗：在連續(xù)5 d定位航行實驗中，隨著訓練時間的延長，空白組小鼠找到平臺的潛伏期逐漸縮短，與空白組比較，模型組小鼠找到平臺的潛伏期明顯延長（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方高劑量組小鼠在第1、2、4天找到平臺的潛伏期明顯縮短（P<0.05）；益智方的低、中、高劑量組小鼠在第5天找到平臺的潛伏期明顯縮短（P<0.05）。（見圖3）

圖3 各組小鼠定位航行實驗逃避潛伏期比較（±s，n=12）

各組小鼠訓練第5天的典型游泳熱力圖見圖4?？瞻捉M小鼠以最短的時間找到了平臺，而模型組小鼠表現為沿著池壁尋找平臺，無法確定平臺位置，益智方高劑量組小鼠尋找平臺的模式明顯優(yōu)于模型組，益智方低、中劑量組小鼠尋找平臺模式稍遜，但最終均確定了平臺的位置。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙。

圖4 各組小鼠Morris水迷宮訓練第5天定位航行典型游泳熱力圖（n=12）

2.3.2 各組小鼠逃逸平臺滯留時間和有效區(qū)域進入次數比較 空間探索實驗：與空白組比較，模型組小鼠逃逸平臺滯留時間明顯縮短（P<0.01），60 s內有效區(qū)域進入次數明顯減少（P<0.01），表明造模成功。與模型組比較，益智方低、中、高劑量組小鼠逃逸平臺滯留時間均明顯延長（P<0.05或P<0.01）；益智方低、中、高劑量組小鼠60 s內有效進入次數明顯增加（P<0.05或P<0.01）。提示益智方能明顯改善東莨菪堿致小鼠學習記憶障礙。（見圖5）

圖5 各組小鼠逃逸平臺滯留時間和有效區(qū)域進入次數比較（±s，n=12）

2.4各組小鼠腦組織中ACh、ChAT、AchE含量比較 與空白組比較，模型組小鼠腦組織中ACh、ChAT含量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01），AchE含量明顯增加（P<0.05）；與模型組比較，益智方中、高劑量組小鼠腦組織中ACh和ChAT的含量顯著增加（P<0.05或P<0.01），而AChE含量顯著減少（P<0.05）。益智方低劑量組小鼠腦組織中ACh、ChAT、ChAE含量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表1）

表1 各組小鼠腦組織中ACh、AchE、ChAT含量比較（±s）

表1 各組小鼠腦組織中ACh、AchE、ChAT含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，dP<0.01

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3 討 論

學習記憶是人體生理發(fā)育過程中一個極其復雜的過程，涉及多個系統、多個環(huán)節(jié)、多種因素。東莨菪堿是一種抗膽堿藥，能使實驗動物學習記憶功能減退，被廣泛應用于藥理評價和作用機制探討[11]。本研究成功復制了東莨菪堿所致的小鼠學習記憶障礙模型。

Morris水迷宮是現今研究者們所公認的用來測試空間學習記憶行為學的經典方法，實驗動物在水中尋找平臺對腦組織中海馬體的學習記憶功能反應極其強烈，常被用來測試AD患者或測試年齡相關的學習記憶障礙的研究[12]；跳臺實驗和避暗實驗都是用來測試動物在受到電刺激時對其制造出不利的環(huán)境影響，經過若干次訓練，通過被動躲避方式躲避其不利環(huán)境給它們帶來的不利影響，從而評價其學習記憶能力。

ACh廣泛存在于腦內且是一種重要的中樞膽堿神經遞質，能維持膽堿能系統正常運行和長期記憶的生理基礎。研究表明，癡呆患者腦組織中樞神經系統中普遍存在Ach含量降低，Ach在腦中含量的減少可以引起學習記憶障礙[13]，可推測膽堿能通路的受損與學習記憶能力的下降具有因果關系。AchE作為ACh的關鍵水解酶，通過水解ACh控制膽堿能神經元突觸間的信息傳遞，從而實現對記憶功能的調控，AchE含量升高可造成腦內ACh含量不足導致學習記憶能力下降[14]；ChAT是ACh的合成酶，ACh由膽堿、乙酰輔酶A協助，并在膽堿乙酰轉移酶（ChAT）催化下合成，兩者的含量及活性直接影響ACh的含量且共同維持著ACh的動態(tài)平衡。本實驗結果顯示，益智方高劑量組小鼠腦組織中AchE含量顯著減少，ACh、ChAT含量顯著增加，可推測其益智作用是通過調控AchE進而影響了Ach、ChAT含量，從而改善小鼠學習記憶的能力。

以熟地黃、山茱萸、山藥、遠志、益智仁為主的復方在治療記憶減退、老年健忘等方面的應用越來越多?，F代研究表明[15-21]，熟地黃、遠志、益智仁均可改善東莨菪堿致學習記憶障礙模型小鼠抑制的中樞神經系統功能及大腦中乙酰膽堿的功能，其作用機制可能為通過提高ChAT活性、抑制AChE活性來增強膽堿能神經系統功能。本實驗結果表明，高劑量益智方可顯著提高東莨菪堿致學習記憶障礙模型小鼠腦組織ChAT含量，減少AchE含量，與文獻相符。研究[22-26]表明，山茱萸多糖、山藥多糖可通過增強腦組織的ATP酶活性、抑制衰老的相關信號節(jié)點和通路來減緩東莨菪堿致小鼠腦組織中Aβ的形成，且能通過降低Tau蛋白磷酸化來改善學習記憶障礙。

綜上所述，益智方可以改善小鼠東莨菪堿所致學習記憶障礙，該方可能通過膽堿能通路調節(jié)機體腦內ACh水平，進而調節(jié)膽堿能的相關神經功能，從而改善學習記憶功能。由此可知，益智方可能主要通過調節(jié)膽堿能系統達到改善小鼠學習記憶障礙的作用。