黃夢(mèng)蘭，馬瑞鶯，肖宇，黃美英，黃非凡，黃芳，鮑美霜，王潔

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 廣西百色市人民醫(yī)院，右江民族醫(yī)學(xué)院附屬西南醫(yī)院，廣西 百色 533000；3. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)是指各原因引起的腎小球?yàn)V過率<60 ml/(min·1.73 m2)或腎臟損傷>3個(gè)月的一類疾病[1]。在過去的30年里CKD在世界人口疾病死亡率排行榜上排名不斷攀升，2016年排名第16位，預(yù)測(cè)2040年將上升至第5位[2]，已被視為重要的全球公共衛(wèi)生事件。隨著人們對(duì)CKD的認(rèn)識(shí)不斷加深，其并發(fā)癥也得到了廣泛的研究。其中，神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥幾乎發(fā)生在所有患有嚴(yán)重CKD的患者中，而早期CKD也可能合并認(rèn)知功能障礙[3]。多項(xiàng)研究已證實(shí)腎小球?yàn)V過率越低，發(fā)生認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)越高，且程度越重[4]。然而CKD合并認(rèn)知功能障礙的機(jī)制尚有許多未解之謎，需要深入的探究，而構(gòu)建合適的動(dòng)物模型是深刻揭示CKD認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)。但目前國(guó)內(nèi)針對(duì)CKD合并認(rèn)知功能障礙的動(dòng)物模型研究較少。本研究擬使用兩次尾靜脈注射阿霉素誘導(dǎo)CKD，并在不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行認(rèn)知功能的行為學(xué)檢測(cè)，探索CKD合并認(rèn)知功能障礙大鼠模型的建立，為疾病的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)10周齡雄性Wistar大鼠，22只，體重約250 g，由長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，SCXK(湘)2019-0014。實(shí)驗(yàn)大鼠分籠飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，SYXK(桂)2017-0004，溫度25°、12 h光照/黑暗交替、45%濕度的環(huán)境中，自由飲水，進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)普通飼料。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 藥物及主要試劑 注射用鹽酸阿霉素50毫克/支(MedChemExpress公司，批號(hào)58647)。尿蛋白定量試劑盒、尿素氮試劑盒、肌酐試劑盒(南京建成)。

1.1.3 主要儀器 高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)、多功能酶標(biāo)儀(德國(guó)Berthold)、全自動(dòng)脫水機(jī)(德國(guó)徠卡)、LEICA RM2235切片機(jī)(德國(guó)徠卡)、全自動(dòng)染色機(jī)(德國(guó)徠卡)、顯微鏡(NIKON Eclipse Ci)、電子天平(上海梅特勒一托利多)、Morris水迷宮(上海吉量)。

1.2 方法

1.2.1 造模與分組 取22只Wistar大鼠隨機(jī)分為3組，A組：正常對(duì)照組(n=6)，B組：模型10周組(n=8)，C組：模型14周組(n=8)。造模方法：按4 mg/kg阿霉素予尾靜脈注射1次，于2周后按相同劑量予第二次尾靜脈注射。B、C組按以上方法造模，B組較C組晚4周進(jìn)行；A組予等量生理鹽水(見圖1)。

注：A組為對(duì)照組，于實(shí)驗(yàn)開始第0周和第2周末予生理鹽水；B組于實(shí)驗(yàn)開始第4周和第6周末予阿霉素；C組為模型14周組，與A組同步注射阿霉素。

1.2.2 稱重 各組大鼠于第一次注射阿霉素前及第二次注射阿霉素后4周、8周、12周分別測(cè)體重。

1.2.3 收集尿液 第14周末用大鼠代謝籠收集24 h尿液，記尿量，并予離心(5000 r/min，3 min，4°)取上清備用。

1.2.4 認(rèn)知功能檢測(cè)-Morris水迷宮

1.2.4.1 定位航行試驗(yàn) 將水放入水池內(nèi)使平臺(tái)淹沒在水面以下1 cm處，水溫約25℃。周圍設(shè)布簾，簾上有醒目圖案，將水池分為東、南、西、北4個(gè)象限，平臺(tái)放在東北象限。每天大鼠被從不同的方位(東南、西南、東北、西北)放入水中同時(shí)開始記錄。最長(zhǎng)游泳時(shí)間設(shè)為90 s。如果大鼠在90 s之前到達(dá)站臺(tái)，并在平臺(tái)上停留10 s時(shí)結(jié)束計(jì)時(shí)。如果超過90 s大鼠仍未到達(dá)平臺(tái)，將大鼠引導(dǎo)到平臺(tái)，并在平臺(tái)上停留30 s。按以上步驟共訓(xùn)練6 d并記錄逃避潛伏期(即大鼠入水后到其第1次登臺(tái)所用的時(shí)間)。

1.2.4.2 空間探索實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)第7天，將平臺(tái)從池中取出，將大鼠從西南象限放入水中，大鼠自由游泳90 s，記錄其游泳軌跡及穿越平臺(tái)次數(shù)。

1.2.5 取材及標(biāo)本備制 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉大鼠，摘眼球法取血，血液在室溫靜置1 h后離心取上清即為血清標(biāo)本。取出腎臟并置入4%多聚甲醛固定24 h后，使用全自動(dòng)脫水機(jī)脫水，浸蠟包埋，將包埋后的腎組織在切片機(jī)上以3 μm厚度切片備HE染色。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo) 檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白定量、血清肌酐及尿素氮。HE染色觀察腎組織病理。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模前各組大鼠的體重?zé)o顯著差異，于阿霉素注射后第1～2周后B、C組大鼠均出現(xiàn)進(jìn)食減少、消瘦、脫毛、活動(dòng)能力減退、眼周及陰囊水腫的表現(xiàn)，部分出現(xiàn)腹瀉或消化道出血等。B、C組大鼠造模后體重較A組明顯下降(P<0.001)，而B、C組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。期間共有4只大鼠死亡，死亡率為25%，多在注射后2～4周死亡。

表1 各組大鼠的體重變化 單位：g

2.2 24 h尿蛋白定量及血清肌酐、尿素氮測(cè)定 B、C組24 h尿蛋白定量較A組升高(P<0.001)；血清肌酐和尿素氮水平也升高(P<0.05)，而B、C兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠的尿蛋白及血清肌酐、尿素氮的比較

2.3 Morris水迷宮 在定位航行實(shí)驗(yàn)中，第1～5天各組大鼠的潛伏期無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，第6天時(shí)C組大鼠潛伏期較A組長(zhǎng)(P<0.05)，B組與A組比較潛伏期無明顯差異(P>0.05)。在空間探索實(shí)驗(yàn)中，C組大鼠穿臺(tái)次數(shù)較A組減少(P<0.05)，而B組與A組比較穿臺(tái)次數(shù)無明顯差異(P>0.05)，見表3。

表3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 病理結(jié)果 HE染色光學(xué)顯微鏡可見：A組腎小球及腎小管結(jié)構(gòu)完整(見圖2a)，B組腎組織結(jié)構(gòu)異常，腎小管數(shù)量明顯減少，管腔廣泛擴(kuò)張，大量腎小管上皮細(xì)胞數(shù)量減少，并可見大量蛋白管型，部分腎小管變性壞死(見圖2b)；C組除B組出現(xiàn)的損害外，還可見部分腎小球毛細(xì)血管袢擴(kuò)張，部分腎小球萎縮，囊腔可見大量蛋白黏液；間質(zhì)可見大量纖維組織增生，及炎癥細(xì)胞灶性浸潤(rùn)(見圖2c)。觀察海馬CA1區(qū)：A組細(xì)胞數(shù)量未見減少，排列較為整齊(見圖2d)；B組細(xì)胞數(shù)量有所減少，排列稍紊亂(見圖2e)；C組細(xì)胞數(shù)量減少，可見部分神經(jīng)元變性，胞體固縮深染(見圖2f)。

圖2 各組大鼠腎臟及海馬CA1區(qū)的HE染色

3 討論

認(rèn)知功能障礙在CKD中具有較高發(fā)病率，臨床中常依賴于蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表等各種量表來評(píng)估認(rèn)知功能[5]。但在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方面，尚未有明確指標(biāo)驗(yàn)證模型的成功，多數(shù)研究通過Morris水迷宮等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評(píng)估組間差異的顯著性來判斷有無認(rèn)知功能障礙[6-7]。本文旨在通過建立腎臟損害模型，研究其并發(fā)癥——認(rèn)知功能障礙出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)。建立CKD小鼠模型常用的有物理法，包括腎大部分切除法(約5/6)、腎動(dòng)脈分支部分結(jié)扎方法、單側(cè)輸尿管結(jié)扎法[8]；化學(xué)法，藥物包括腺嘌呤、阿霉素、順鉑[9-10]；基因工程法，包括特定基因敲除和基因干擾等?；谄渌炷７绞綄?duì)技術(shù)水平的高要求，故本研究選用阿霉素誘導(dǎo)大鼠腎臟損害。鑒于阿霉素的毒副作用，其誘導(dǎo)的腎病在疾病早期與臨床存在一定差異，但當(dāng)腎臟損害到一定程度——大量蛋白尿、血清肌酐及尿素氮升高、腎臟病理改變等時(shí)，其與人類CKD具有顯著相似性[11-12]。阿霉素腎病的損害程度與注射劑量呈正相關(guān)，給藥劑量多控制在10 mg/kg以內(nèi)，且較低劑量阿霉素多次注射不僅能造成持續(xù)的腎損傷且具有較低死亡率和更高穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)[13-14]。故本研究選用間隔2周兩次尾靜脈注射阿霉素的方法，結(jié)果顯示模型組大鼠均出現(xiàn)了大量蛋白尿、血清肌酐及尿素氮升高、慢性腎炎的病理改變，與其他以阿霉素造模的研究所得腎病模型相類似[15-16]。阿霉素通過激活氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡和腎臟纖維化促使腎臟病變，其病變發(fā)展過程與臨床腎病的發(fā)展規(guī)律相似[17-18]。而C組腎功能損害較B組稍重，這與腎臟損害持續(xù)進(jìn)展有關(guān)。認(rèn)知功能包括記憶力、計(jì)算力等。其中海馬是記憶功能形成和維持不可或缺的重要部分，尤其是CA1區(qū)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)及蛋白變化[19]。當(dāng)海馬CA1區(qū)的細(xì)胞形態(tài)發(fā)生凋亡、萎縮時(shí)，實(shí)驗(yàn)鼠顯示出記憶功能受損[20]。實(shí)驗(yàn)中海馬組織HE染色可見模型海馬組織CA1區(qū)細(xì)胞均有損害，但C組更為明顯，表現(xiàn)為細(xì)胞數(shù)量減少，排列稍紊亂，部分神經(jīng)元變性，胞體固縮深染等。Morris水迷宮利用動(dòng)物厭惡水環(huán)境的特性，強(qiáng)迫動(dòng)物游泳并從水中逃跑來激發(fā)其學(xué)習(xí)記憶能力，用于評(píng)估嚙齒動(dòng)物的空間探索和學(xué)習(xí)記憶能力[21]。本研究中C組大鼠的潛伏期延長(zhǎng)且穿臺(tái)次數(shù)減少，可見C組大鼠的空間探索和記憶功能減退。Fujisaki K等[7]通過5/6腎臟切除的方法制備CKD小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在放射臂水迷宮CKD 8周小鼠的空間記憶較CKD 4周的減退，與本研究的結(jié)果相似。雖本研究的周期相對(duì)較長(zhǎng)，這可能與動(dòng)物的種屬和誘導(dǎo)腎臟損傷的周期不同有關(guān)，但是本研究死亡率低，成本低，技術(shù)難度不高，利于實(shí)施。有研究表明，CKD患者合并認(rèn)知障礙的程度與腎功能衰竭程度密切相關(guān)[22]。腎臟是清除β淀粉樣蛋白的主要器官，腎臟受損加重腦內(nèi)β淀粉樣蛋白的沉積，從而加重認(rèn)知缺陷[23]。而且，腎功能受損會(huì)導(dǎo)致腦微血管系統(tǒng)的改變，從而影響大腦的健康[24]。多數(shù)研究已表明尿毒癥毒素及血管病變是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要因素[25]。

綜上所述，本研究通過尾靜脈注射阿霉素建立CKD合并認(rèn)知障礙的大鼠模型，該模型簡(jiǎn)便易行，死亡率低，且確定了認(rèn)知功能出現(xiàn)明顯障礙的時(shí)間點(diǎn)，為進(jìn)一步探究CKD合并認(rèn)知障礙的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

聲明: 本研究不存在任何利益沖突。