黃新亮，余方流，王鳳各，董博翰

(皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約有2.57億乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)慢性感染者，每年約有88.7萬(wàn)人死于HBV感染相關(guān)疾病。中國(guó)一般人群慢性HBV感染者約7 000萬(wàn)例，對(duì)中國(guó)社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究者發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)的功能低下可導(dǎo)致患者體內(nèi)T、B細(xì)胞的耐受狀態(tài)[2]。如何制備DC疫苗、增強(qiáng)其免疫活性及抗HBV的細(xì)胞毒效應(yīng)成為難題。

DC疫苗的安全性方面，德國(guó)美因茨大學(xué)(Mainz University)Jonuleit H等[3]發(fā)現(xiàn)TNF-a、IL-1b和IL-6 3種CK(細(xì)胞因子)組合后，在無(wú)牛血清培養(yǎng)體系中能夠?qū)⑽闯墒霥C誘導(dǎo)成完全成熟的DC，避免了動(dòng)物血清培養(yǎng)DC對(duì)人產(chǎn)生的毒副作用。DC疫苗的有效性方面，Tomoko Ichiyanagi發(fā)現(xiàn)經(jīng)42℃熱應(yīng)激后DC中的內(nèi)源性熱休克蛋白即HSP90對(duì)OVA抗原在抗原交叉呈遞過(guò)程中也起著至關(guān)重要的作用[4]；也有研究者在Nature期刊發(fā)文指出外來(lái)的HSP亦能促進(jìn)DC成熟[5]。

本研究基于DC的安全應(yīng)用技術(shù)和熱休克蛋白增強(qiáng)疫苗有效性的理論，進(jìn)一步探討熱應(yīng)激和HBsAg刺激的樹突狀細(xì)胞的免疫特性(成熟度、HSP90的表達(dá)及功能、激活CTL的能力)及其誘導(dǎo)的特異性CTL的細(xì)胞毒效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)象 選擇健康志愿者，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡均為20歲，經(jīng)健康體檢HBV為陰性且無(wú)乙型肝炎發(fā)病史。

1.1.2 主要試劑 靜脈血中分離的人淋巴細(xì)胞。HBsAg、無(wú)血清AIM-V培液、HepG2.2.15(轉(zhuǎn)染HBV的DNA)、熒光素標(biāo)記抗人CD3單克隆抗體和抗人CD8單克隆抗體、IL-2、TNF-α、IL-4、IL-1b、IL-6和GM-CSF(Biolegend公司)；HSP90的ELISA 試劑盒(上海森雄科技有限公司進(jìn)口分裝)。

1.2 方法

1.2.1 制備DC疫苗 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分4組，每組7例。熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組：即HBsAg聯(lián)合42℃加熱刺激DC。利用密度梯度離心法分離人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，將分離的PBMC置于4孔板中，在37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h； 4孔板中貼壁的為DC(收集未貼壁的細(xì)胞并且凍存，以便后期和DC共培養(yǎng))。向4孔板中加入3毫升/孔無(wú)血清AIM-V培液和100 ng/ml GM-CSF、100 ng/ml IL-4。第4天DC中加入HBsAg(10 ng/ml)并經(jīng)過(guò)42℃培養(yǎng)30 min。加入CK后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，CK按照文獻(xiàn)常規(guī)加入：TNF-a 10 ng/ml、IL-1b 10 ng/ml、IL-6 1000 U/ml，收集第8天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DC準(zhǔn)備鑒定[3]。熱應(yīng)激組：DC經(jīng)過(guò) 42℃培養(yǎng)30 min，不負(fù)載HBsAg，其余和熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組相同。HBsAg組：DC負(fù)載HBsAg，不用42℃溫度處理，其余和熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組相同。對(duì)照組：DC不負(fù)載HBsAg、也不經(jīng)42℃溫度處理，其余和熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組相同。

1.2.2 流式細(xì)胞儀鑒定 DC培養(yǎng)過(guò)程中，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組DC表面標(biāo)志分子CD80、CD40及HLA-DR的變化。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)HSP90 按照熱休克蛋白90(HSP-90)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)，于波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔的A值，以吸光度A值為縱坐標(biāo)(Y)，相應(yīng)的HSP-90標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X)，做得相應(yīng)的曲線，樣品的HSP-90含量可根據(jù)其A值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

1.2.4 DC刺激自身淋巴細(xì)胞反應(yīng)與鑒定的方法 各組DC疫苗刺激自身淋巴細(xì)胞：收集第8天實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的DC，計(jì)數(shù)以1×106個(gè)/毫升作為刺激細(xì)胞，加入到4孔板中(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組DC數(shù)相同)。復(fù)蘇凍存的初始T細(xì)胞，計(jì)數(shù)，按T細(xì)胞：DC=20∶1的比例往DC中加入初始T淋巴細(xì)胞。加入500 IU/ml IL-2，置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后收集活化的T細(xì)胞。臺(tái)盼藍(lán)染色后顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和活性。檢測(cè)CD8+T細(xì)胞：每孔100 μl PBMC細(xì)胞懸液中加入5 μl PE標(biāo)記的抗人CD3克隆抗體、5 μl FITC標(biāo)記抗人CD8單克隆抗體，4℃避光染色30 min，用3%FBS-PBS洗細(xì)胞1次，懸浮于500 μl 3%FBS-PBS中，4℃避光保存，熒光抗體染色后，用流式細(xì)胞儀C6檢測(cè)，獲取細(xì)胞數(shù)不少于100 000個(gè)。

1.2.5 LDH法檢測(cè)DC誘導(dǎo)的特異性 CTL細(xì)胞毒效應(yīng)檢測(cè)細(xì)胞毒性T細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)殺傷活性以乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)法，靶細(xì)胞為HepG2.2.15(轉(zhuǎn)染HBV的DNA)，效靶比為1∶25。CTL殺傷活性=(效靶混合細(xì)胞釋放A值-自然釋放A值)/(最大釋放A值-自然釋放A值)。

2 結(jié)果

2.1 各組DC中表達(dá)CD80、CD40、HLA-DR的比率比較 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組(heat stress combined with HBsAg組)DC中表達(dá)CD80、CD40、HLA-DR分子的比率顯著高于熱應(yīng)激組(heat stress組)、HBsAg組和對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

注：A為CD80表達(dá)；B為CD40表達(dá)；C為HLA-DR表達(dá)；與control組比較，*P<0.05；與heat stress組比較，#P<0.05；與HBsAg組比較，△P<0.05。

2.2 各組DC中表達(dá)HSP90水平比較 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組DC中表達(dá)HSP90水平顯著高于熱應(yīng)激組、HBsAg組和對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

注：與control組比較，*P<0.05；與heat stress組比較，#P<0.05；與HBsAg組比較，△P<0.05。

2.3 各組DC中HSP90水平與表達(dá)CD80、CD40及HLA-DR的比率的線性相關(guān)分析 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組HSP90水平與DC中表達(dá)CD80、CD40及HLA-DR的比率呈現(xiàn)正相關(guān)(見(jiàn)圖3)，相關(guān)系數(shù)r分別是0.73、0.69、0.78；熱應(yīng)激組、HBsAg組、對(duì)照組HSP90水平與該組DC中表達(dá)CD80、CD40及HLA-DR的比率呈現(xiàn)無(wú)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)=0)。

圖3 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組HSP90與CD80、CD40、HLA-DR的比率的線性相關(guān)分析

2.4 各組DC刺激自身淋巴細(xì)胞增殖的比率 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組DC刺激自身淋巴細(xì)胞增殖，T細(xì)胞中CD3+CD8+T的比率顯著高于熱應(yīng)激組、HBsAg組和對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

注：與control組比較，*P<0.05；與heat stress組比較，#P<0.05；與HBsAg組比較，△P<0.05。

2.5 各組DC誘導(dǎo)的特異性CTL細(xì)胞毒效應(yīng) 熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg組CTL殺傷活性的百分率明顯高于熱應(yīng)激組、HBsAg組和對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組DC誘導(dǎo)的CTL對(duì)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒效應(yīng)

3 討論

本研究為探索DC免疫活性的增強(qiáng)提供了新思路。Ichiyanagi T等[4]發(fā)現(xiàn)經(jīng)42℃熱應(yīng)激后DC中的內(nèi)源性HSP90對(duì)OVA抗原在抗原交叉呈遞過(guò)程起著至關(guān)重要的作用；也有研究者發(fā)現(xiàn)DC之外的外源性HSP與CD91受體結(jié)合進(jìn)入樹突狀細(xì)胞，亦能促進(jìn)DC成熟[5]。HSP70/HBxAg復(fù)合物促進(jìn)DC的成熟、HSP通過(guò)MHCI和Ⅱ類分子將腫瘤相關(guān)抗原呈遞給抗腫瘤CD8+T和CD4+T細(xì)胞并使之活化，這將會(huì)促進(jìn)針對(duì)癌癥和傳染病的新一代預(yù)防和治療候選DC疫苗的產(chǎn)生[6-8]。而本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg刺激的DC比HBsAg和熱應(yīng)激分別刺激的DC抗原提呈活性更強(qiáng)，且能誘導(dǎo)自身淋巴細(xì)胞增殖、產(chǎn)生更多特異性CTL。這些發(fā)現(xiàn)為探索DC免疫活性的增強(qiáng)提供了新途徑。

本研究為提高CTL抗HBV的細(xì)胞毒效應(yīng)提供新佐證。已有研究表明，慢性HBV感染者發(fā)生免疫耐受的重要原因是HBsAg特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞數(shù)量缺乏和(或)功能不足[9]。因而選擇合適的易受HBV感染的人群進(jìn)行免疫治療，才能體現(xiàn)治療性疫苗的功效[10]。本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg刺激的DC誘導(dǎo)的特異性CTL具有更強(qiáng)的細(xì)胞毒效應(yīng)，這一發(fā)現(xiàn)為探究抗HBV的細(xì)胞毒效應(yīng)提供新佐證。

本研究亦為開(kāi)發(fā)治療慢性乙肝的安全、有效的DC疫苗提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。一方面，本研究從臨床前期研究出發(fā)，以人外周血單個(gè)核細(xì)胞制備DC，在無(wú)動(dòng)物血清培養(yǎng)體系中將未成熟DC誘導(dǎo)成完全成熟的DC；從而避免疫苗中動(dòng)物血清成分對(duì)人體的毒副作用。另一方面，世界衛(wèi)生組織提出了2030年消除病毒性肝炎的目標(biāo)[11-12]，這給有效治療慢性乙型肝炎帶來(lái)挑戰(zhàn)。而本研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg刺激的樹突狀細(xì)胞具有良好的抗原提呈能力，其能誘導(dǎo)更明顯的特異性CTL細(xì)胞毒效應(yīng)。這為臨床研發(fā)有效地治療慢性肝炎的DC疫苗提供依據(jù)，有望成為治療慢性肝炎的新的候選疫苗。從本研究的結(jié)果可知，與熱應(yīng)激、HBsAg分別刺激DC比較，熱應(yīng)激聯(lián)合HBsAg刺激的DC成熟度、HSP90的表達(dá)水平及激活CTL的能力均提升，且能誘導(dǎo)更明顯的特異性CTL細(xì)胞毒效應(yīng)。但HSP90以何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制促進(jìn)DC的免疫活性，有待深入研究。另外受條件限制，未進(jìn)行研究對(duì)象的性別和不同年齡段的分類研究，因而研究結(jié)果有一定的局限性。