辛乃宏，楊俊濤，李炳乾，陳慶亞，王新磊，趙喜榮，艾日肯江·庫爾班江

(1.中鹽工程技術(shù)研究院有限公司，天津 300450；2.精河縣精河鹽化有限責(zé)任公司，新疆 精河 833300)

鹽藻(Dunaliellasalina)又稱杜氏藻，為雙鞭毛單細(xì)胞微藻。1838年，由法國生物學(xué)家Michel Felix Dunal在法國南部地中海沿岸蒙彼利埃(Montpellier)的鹽池鹵水中發(fā)現(xiàn)。1905年，Teodoresco[1]將此藻在杜氏藻屬中做了分類描述，并定名“鹽生杜氏藻”(D.salinaTeodoresco)。鹽藻是已知的地球上最耐鹽的光合真核生物，且具有廣泛適鹽和適溫范圍，海水(3% NaCl)到飽和鹵水(31% NaCl)，耐受溫度從低于0 ℃到大于38 ℃[2-3]。鹽藻藻體內(nèi)有一杯狀色素體，可積累類胡蘿卜素，以油滴的形式分布于葉綠體的周圍，其β-胡蘿卜素含量為自然界生物之首[3]，含量高達(dá)14%。鹽藻類胡蘿卜素由順式和反式β-胡蘿卜素的異構(gòu)體構(gòu)成[4]，一個典型的鹽藻類胡蘿卜素的組成為：15-cis-β-胡蘿卜素占10%；9-cis-β-胡蘿卜素占41%；全反式β-胡蘿卜素占42%；其它異構(gòu)體占6%[5-6]。鹽藻中還可以積累大量的甘油[7]，含有不飽和脂肪酸、多糖等多種其它活性物質(zhì)，鹽藻在食品及水產(chǎn)飼料領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[8]。

國外對鹽藻的研究長達(dá)100多年[9]。國外鹽藻規(guī)?；B(yǎng)殖主要在澳大利亞和以色列，這兩個國家采取不同的養(yǎng)殖模式，澳大利亞采用一種粗放式的養(yǎng)殖模式，這種模式利用西澳大利亞瀉湖(HUTT LAGOON)的自然鹽湖，建成大約每個養(yǎng)殖池5 hm2的鹽藻養(yǎng)殖池，在大約25%的高鹽度下養(yǎng)殖，養(yǎng)殖鹵水取自鹽湖，用海水調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池的鹽度，添加營養(yǎng)鹽，靠自然的風(fēng)力攪拌，養(yǎng)殖周期大約9個月[10-11]。以色列鹽藻養(yǎng)殖采用的是半精養(yǎng)模式，跑道池養(yǎng)殖，攪拌槳攪拌，通入二氧化碳，這種模式養(yǎng)殖密度較高，生物量增殖可以達(dá)到2 g/m2·d，鹽藻生物量可以達(dá)到0.3 g/L，鹽藻粉胡蘿卜素含量平均5%，鹽藻產(chǎn)量和質(zhì)量較為可控[12-13]。

我國的鹽藻養(yǎng)殖從20世紀(jì)80年代開始，目前的規(guī)?；B(yǎng)殖面積較小，主要受到高鹽度鹵水條件和氣候的限制[14-15]。新疆的高光照、少雨和高溫等氣候條件對于養(yǎng)殖鹽藻生產(chǎn)β-胡蘿卜素十分有利[16]。文章通過在新疆艾比湖使用鹽田儲鹵池，利用當(dāng)?shù)鬲毺氐臍夂驐l件大面積養(yǎng)殖鹽藻，拓展了國內(nèi)鹽藻的養(yǎng)殖區(qū)域，提高鹽藻的養(yǎng)殖產(chǎn)量，降低鹽藻的養(yǎng)殖成本。

1 材料與方法

1.1 藻種

鹽藻藻種選自精河縣精河鹽化有限責(zé)任公司艾比湖鹽田儲鹵池，經(jīng)分離純化獲得純鹽藻藻種D.salina，編號為ZYXJA-1。該藻種用于試驗的擴(kuò)種及大面積養(yǎng)殖試驗。

1.2 鹵水

使用精河縣精河鹽化有限責(zé)任公司艾比湖鹽田儲鹵池中鹵水，鹽度18 °Be′～22 °Be′。

1.3 鹽藻擴(kuò)種及養(yǎng)殖設(shè)施

1.3.1 室內(nèi)擴(kuò)種室

陽光溫棚，內(nèi)有能放置5 L三角瓶支架，內(nèi)有長15 m，寬2.80 m， 深40 cm，面積42 m2的鋼筋混凝土跑道池，配備攪拌槳。

1.3.2 室外一級擴(kuò)種跑道池

室外一級擴(kuò)種采用鋼筋混凝土跑道池，長120 m，寬10 m，深40 cm，面積1 200 m2，配備攪拌槳。

1.3.3 室外二級擴(kuò)種跑道池

室外二級擴(kuò)種采用土池簡易跑道池，長250 m，寬60 m，面積15 000 m2，池底采用細(xì)小碎石鋪底，碎石護(hù)坡，配備攪拌槳。

1.3.4 大面積養(yǎng)殖池

使用精河縣精河鹽化有限責(zé)任公司8號儲鹵庫，該儲鹵庫南北長400 m，東西寬250 m，面積100 000 m2，池底采用細(xì)小碎石鋪底，碎石護(hù)坡。

1.4 鹽藻藻種的擴(kuò)培

1.4.1 三角瓶藻種一級擴(kuò)培

在5 L三角瓶中加入體積3 000 mL 20 °Be′的鹵水，使用高壓滅菌鍋120 ℃滅菌20 min，冷卻至室溫后加入營養(yǎng)鹽，按照約3萬細(xì)胞/mL的密度接入鹽藻藻種ZYXJA-1。接種后的三角瓶置于室內(nèi)擴(kuò)種室的支架上，每天上下午各搖動一次，觀察鹽藻的生長狀況。

1.4.2 室內(nèi)跑道池二級擴(kuò)培

在面積42 m2的跑道池中加入20 cm水深、20 °Be′經(jīng)蒸汽消毒的鹵水，待水溫降至室溫后，加入營養(yǎng)鹽，接入不少于50瓶的5 L三角瓶密度大約50萬細(xì)胞/mL的鹽藻，白天定時開啟攪拌裝置，每天檢測鹽藻密度及雜藻情況。

1.4.3 室外跑道池一級擴(kuò)培

在面積1 200 m2的室外跑道池中加入水深20 cm、20 °Be′的鹵水，加入營養(yǎng)鹽，開啟攪拌裝置，緩慢加入50 mg/kg有效氯10%的次氯酸鈉溶液，攪勻后靜置24 h，取樣觀察有無活的雜藻及敵害生物。檢測無余氯后，接入3個室內(nèi)跑道池的藻種，接種密度控制在3萬細(xì)胞/mL以上。白天定時開啟攪拌裝置，每天檢測鹽藻密度及雜藻情況?？刂起B(yǎng)殖水體在18 °Be′～23 °Be′。

1.4.4 室外跑道池二級擴(kuò)培

在面積15 000 m2的室外二級擴(kuò)種跑道池中加入20 °Be′的鹵水，加入營養(yǎng)鹽，開啟攪拌裝置，緩慢加入50 mg/kg有效氯10%的次氯酸鈉溶液，攪勻后靜置24 h，取樣觀察有無活的雜藻及敵害生物。檢測無余氯后，接入1個室外一級跑道池的藻種，接種密度控制在3萬細(xì)胞/ml以上。白天定時開啟攪拌裝置，每天檢測鹽藻密度及雜藻情況?？刂起B(yǎng)殖水體在20 °Be′～23 °Be′。

1.4.5 室外大面積養(yǎng)殖

在100 000 m2儲鹵池中加入水深20 cm，20 °Be′的鹵水，加入營養(yǎng)鹽，在有風(fēng)時的上風(fēng)口接入15 000 m2的室外二級擴(kuò)種跑道池中的鹽藻種，接種密度控制在3萬細(xì)胞/mL以上。依靠該地區(qū)的自然風(fēng)力攪拌，控制養(yǎng)殖水體濃度22 °Be′～24 °Be′。每天檢測鹽藻的密度和雜藻的密度，定期測定水體中的胡蘿卜素含量。

1.5 鹽藻及水體中胡蘿卜素的檢測方法

1.5.1 鹽藻密度檢測方法

鹽藻密度計算采用微生物顯微計數(shù)——血球計數(shù)板法。

1.5.2 鹽藻養(yǎng)殖水體中胡蘿卜素含量檢測方法

取5 mL待檢測水體置于比色管中，向比色管中加入3 mL～5 mL 90%的丙酮溶液，充分振蕩后靜置分層；待上層萃取液顏色不變后，用吸管吸取到另一25 mL比色管中；重復(fù)上述步驟，直至萃取無色；將萃取液用90%丙酮稀釋至25 ml刻度線，用分光光度計(波長450 nm)測量吸光度A值。水體胡蘿卜素濃度計算公式為：

βC=20A

(1)

式中：βC——水體中胡蘿卜素含量，mg/L；A——吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 大面積鹽藻養(yǎng)殖擴(kuò)養(yǎng)體系的建立

試驗通過建立2級室內(nèi)擴(kuò)種(5 L三角瓶、42 m2跑道池)和三級室外鹽藻擴(kuò)培(1 200 m2室外跑道池、15 000 m2室外跑道池、100 000 m2儲鹵池)的鹽藻擴(kuò)養(yǎng)體系(圖1)，較好地保證每一級鹽藻擴(kuò)種的接種密度，有效地控制大面積養(yǎng)殖池雜藻競爭問題。

圖1 大面積鹽藻養(yǎng)殖擴(kuò)培體系Fig.1 Large scale culture system of Dunaliella Salina

2.2 鹽藻生長情況

2.2.1 室內(nèi)跑道池鹽藻生長情況

鹽藻ZYXJA-1在2017-09-28從5 L三角瓶接種到3號育種室的跑道池，密度1萬細(xì)胞/mL，至2017-11-20由于室溫維持在10 ℃以上，鹽藻生長較快，密度達(dá)到33萬細(xì)胞/mL。2017-11～2018-03，由于氣溫長期維持在10 ℃以下，有時甚至0 ℃以下，鹽藻生長緩慢，鹽藻密度維持在30萬細(xì)胞/mL～38萬細(xì)胞/mL之間。2018-03中旬，由于氣溫回升，鹽藻開始生長，至2018-03-18鹽藻密度達(dá)到42萬細(xì)胞/mL。此育種室的鹽藻作為1號育種室和2號育種室的鹽藻種源，進(jìn)行鹽藻的擴(kuò)種。

2018-03，將3號育種室的鹽藻接到2號育種室的跑道池中，2號育種池的接種密度為20萬細(xì)胞/mL，擴(kuò)種期間2號育種室的室溫維持在14 ℃～21 ℃之間，鹽藻實現(xiàn)較快的生長，12 d養(yǎng)殖周期，鹽藻由20萬細(xì)胞/mL增至80萬細(xì)胞/mL。鏡檢在育種室跑道池中未發(fā)現(xiàn)雜藻。

2.2.2 室外一級擴(kuò)種跑道池鹽藻生長情況

2018-04-20，將1號～3號育種室的鹽藻接到1號和2號室外1 200 m2跑道池。1號和2號室外1 200 m2跑道池鹽藻生長及氣溫變化見圖2。

圖2 鹽藻在1 200 m2跑道池內(nèi)的生長情況Fig.2 Growth of Dunaliella Salina in 1 200 m2 runway pool

1號池接種密度為5萬細(xì)胞/mL，2號保種池接種密度為4萬細(xì)胞/mL。在21 d養(yǎng)殖周期內(nèi)氣溫在15 ℃～25 ℃之間，鹽藻實現(xiàn)了較快的生長，1號池密度達(dá)到了83萬細(xì)胞/mL，2號池密度達(dá)到了80萬細(xì)胞/mL。在養(yǎng)殖的第7 d鏡檢發(fā)現(xiàn)雜藻，1號池雜藻密度1萬細(xì)胞/mL，2號池雜藻密度2萬細(xì)胞/mL。至養(yǎng)殖周期結(jié)束，2個跑道池的雜藻始終控制在5萬細(xì)胞/mL。

2.2.3 室外二級擴(kuò)種鹽藻生長情況

2018-05-10，將室外1級擴(kuò)種池的鹽藻接種到室外二級擴(kuò)種池(面積15 000 m2)，接種密度5萬細(xì)胞/mL。鹽藻生長及氣溫變化見圖3，在33 d的養(yǎng)殖周期內(nèi)，氣溫變化在16 ℃～35 ℃之間，鹽藻由5萬細(xì)胞/mL增長到52萬細(xì)胞/mL。在養(yǎng)殖第8 d鏡檢發(fā)現(xiàn)雜藻，從最初的1萬細(xì)胞/mL，到第16 d的9萬細(xì)胞/mL，以后始終維持在7萬細(xì)胞/mL～8萬細(xì)胞/mL。

圖3 鹽藻ZYXJA-1在15 000 m2擴(kuò)種池中生長情況Fig.3 Growth of Dunaliella Salina ZYXJA-1 in 15 000 m2 expansion tank

2.2.4 儲鹵池鹽藻生長情況

2018-06-12，將室外二級擴(kuò)種池的鹽藻接到100 000 m2的儲鹵池中，接種密度4萬細(xì)胞/mL。鹽藻生長及氣溫變化見圖4。

圖4 鹽藻在儲鹵池(100 000 m2)中的生長情況Fig.4 Growth of Dunaliella Salina in brine storage tank (100 000 m2)

期間氣溫在28 ℃～35 ℃之間，鹽藻由最初的4萬細(xì)胞/mL，9 d后快速增長到16萬細(xì)胞/mL，再緩慢增長至24萬細(xì)胞/mL。前9 d的養(yǎng)殖周期內(nèi)，雜藻始終控制在1萬細(xì)胞/mL，最后雜藻增長至4萬細(xì)胞/mL。

在儲鹵池養(yǎng)殖的第19 d、第21 d、第22 d、第24 d分別測定水體中胡蘿卜素的含量，其含量分別為8.5 mg/L、9.16 mg/L、9.22 mg/L、9.78 mg/L。

3 討論

3.1 大面積鹽藻養(yǎng)殖擴(kuò)養(yǎng)體系

鹽藻養(yǎng)殖過程中極易受到一種稱為小綠鹽藻(D.viridis)的雜藻污染，綠鹽藻細(xì)胞內(nèi)胡蘿卜素含量很低，在鹽藻養(yǎng)殖過程中綠鹽藻大量繁殖會影響鹽藻D.salina的生長，使鹽藻粉中胡蘿卜素含量降低[17]。此研究建立的體系通過2級室內(nèi)保擴(kuò)種保證了鹽藻種的純度，避免了雜藻的污染，同時保證了接種到室外擴(kuò)種的接種量。利用擴(kuò)種和養(yǎng)殖階段分開和添加不同營養(yǎng)鹽的養(yǎng)殖模式，實現(xiàn)了鹽藻的分段培養(yǎng)模式，可以提高鹽藻種胡蘿卜素的含量[18]。

3.2 室內(nèi)擴(kuò)種情況

通過延續(xù)一個冬季的擴(kuò)種實驗證明鹽藻ZYXJA-1在氣溫15 ℃以上就可以實現(xiàn)快速生長，在低至零下2 ℃情況下藻種依然可以安全越冬。在育種池中鹽藻密度可使用擴(kuò)種的營養(yǎng)鹽配方和較高的接種密度，鹽藻密度可以快速達(dá)到80萬細(xì)胞/mL。室內(nèi)密閉的空間和高溫滅菌鹵水保證了擴(kuò)種鹽藻的純度，整個室內(nèi)擴(kuò)種實驗期間未發(fā)現(xiàn)雜藻污染。

3.3 室外擴(kuò)種情況

由于室外一級擴(kuò)種池較小的水體和較好的攪拌設(shè)施，鹽藻密度可以增長到80萬細(xì)胞/mL。由于受到露天條件的限制，在擴(kuò)種過程中發(fā)現(xiàn)了雜藻的污染，但始終維持在可控的水平內(nèi)，雜藻比例小于6%。在二級室外擴(kuò)種池中，由于養(yǎng)殖水體的擴(kuò)大，鹽藻密度的最高密度達(dá)到50萬細(xì)胞/mL，雜藻控制難度也相應(yīng)加大。

3.4 儲鹵池鹽藻養(yǎng)殖情況

鹽藻大面積養(yǎng)殖特別是100 000 m2單體養(yǎng)殖無攪拌裝置，在營養(yǎng)鹽添加、鹽度調(diào)節(jié)及雜藻控制等都具有較大難度，目前最大鹽藻養(yǎng)殖單體是澳大利亞瀉湖(Hutt Lagoon)，單體養(yǎng)殖面積50 000 m2。由于儲鹵池中的添加的營養(yǎng)為有利于積累胡蘿卜素的配方，鹽藻生長前期相對較快，后期相對緩慢，第1 d至第9 d鹽藻密度達(dá)到16萬細(xì)胞/mL，第10 d至第24 d鹽藻密度由16萬細(xì)胞/mL僅增長到22萬細(xì)胞/mL。

從胡蘿卜素的積累來看，第19 d、第21 d、第22 d、第24 d的胡蘿卜素含量分別為8.5 mg/L、9.16 mg/L、9.22 mg/L、9.78 mg/L，對應(yīng)到單個細(xì)胞的胡蘿卜素含量分別為53.1 pg、48.2 pg、46.1 pg、44.5 pg，對單個細(xì)胞的胡蘿卜素積累來說，應(yīng)該是一個比較高的數(shù)值，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于王富平等[19]在塘沽氣候條件下取得的單體細(xì)胞11.4 pg的結(jié)果，優(yōu)于Ben-Amotz[20]報道的最佳光照條件下單個鹽藻細(xì)胞胡蘿卜素含量積累40 pg的結(jié)果。從單位時間面積胡蘿卜素的積累量來看，第19 d、第21 d、第22 d、第24 d分別為0.089 m2·d、0.087 m2·d、0.084 m2·d、0.082 m2·d，這一數(shù)值略低于以具有攪拌措施和二氧化碳添加的以色列跑道池鹽藻養(yǎng)殖胡蘿卜素的積累1 m2·d的積累量[20]，但作為一種鹽藻的粗養(yǎng)模式，其積累完全可以接受的結(jié)果。

4 結(jié)論

新疆艾比湖氣候條件完全適合鹽藻的大面積培養(yǎng)，養(yǎng)殖周期每年從四月至十月中旬，達(dá)到6個月以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于國內(nèi)其它地區(qū)的養(yǎng)殖周期。新疆艾比湖其較強(qiáng)的日照和多風(fēng)的天氣，使鹽藻養(yǎng)殖密度和胡蘿卜素積累都優(yōu)于國內(nèi)其它地區(qū)的鹽藻養(yǎng)殖。利用鹽田季節(jié)性閑置的儲鹵池可以降低建造鹽藻養(yǎng)殖設(shè)施的基礎(chǔ)投資，可以顯著降低鹽藻的生產(chǎn)成本。