張翠娟，王向真，于幫旭，安 毅，李 丹

（1.青島大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東青島 266000；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉醫(yī)學(xué)科，山東青島 266000；3.青島大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，山東青島266000）

目前，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈支架植入已成為臨床救治冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┑闹匾侄危鵀榱私档椭Ъ苤踩朐侏M窄率，藥物涂層支架應(yīng)運(yùn)而生。但近年來(lái)，由于現(xiàn)有的藥物涂層支架廣泛應(yīng)用于很多復(fù)雜病變，甚至出現(xiàn)很多超適應(yīng)證使用的情況，其再狹窄率再次出現(xiàn)了升高的現(xiàn)象［1-2］?，F(xiàn)有的藥物涂層支架是通過(guò)攜載藥物緩慢釋放，抑制平滑肌的過(guò)度增殖，達(dá)到降低再狹窄的目的，如臨床上常用的雷帕霉素支架，表面攜載的雷帕霉素藥物，是一種大環(huán)內(nèi)酯類藥物，通過(guò)阻斷細(xì)胞周期中的G1 期向S 期的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而阻斷細(xì)胞的復(fù)制，抑制細(xì)胞的過(guò)度增殖。但其在抑制平滑肌細(xì)胞的同時(shí)也會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)，內(nèi)皮愈合延遲導(dǎo)致支架內(nèi)血栓的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高［3］。因此，血管內(nèi)皮細(xì)胞的快速愈合是降低支架內(nèi)再狹窄及支架內(nèi)血栓的有效方法。有研究表明，內(nèi)皮祖細(xì)胞可以形成新生血管，分化成心肌樣組織，對(duì)冠心病患者有良性影響［4］。本課題組率先在國(guó)內(nèi)研究羥丁基殼聚糖攜載CD133抗體溫敏膜涂層藥物支架，即通過(guò)內(nèi)皮祖細(xì)胞表面特異性標(biāo)志物CD133，使攜帶CD133 抗體的支架捕獲含CD133 抗原的內(nèi)皮祖細(xì)胞，并促進(jìn)其在支架上增殖、分化，使之加速血管內(nèi)皮的愈合，在降低再狹窄率及支架內(nèi)血栓方面更具優(yōu)勢(shì)［5-6］。而且殼聚糖能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，且具有良好的血液相容性和抗動(dòng)脈粥樣硬化作用［7］。本文主要通過(guò)顯微鏡觀察、定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）等方法，探究羥丁基殼聚糖攜載CD133抗體溫敏膜相比于臨床常用的鈷鉻合金片、雷帕霉素涂層鈷鉻合金片，對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附、遷移能力，及促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化的作用。

1 材料和方法

1.1 材 料

復(fù)合羥丁基殼聚糖納米載體攜載CD133+抗體溫敏膜由中國(guó)海洋大學(xué)制備；3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物序列、內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（endo?thelial nitric oxide synthase，eNOS）引物由上海生工公司合成；鈷鉻合金片、雷帕霉素涂層鈷鉻合金片由上海微創(chuàng)公司制備；EGM-2 MV SingleQuots培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)LONZA 公司；Dil 標(biāo)記的乙?；兔芏戎鞍祝╝cetylated low density lipoprotein，ac-LDL）、FITC 標(biāo)記的荊豆凝集素I（FITC-UEA-I）均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；FITC 標(biāo)記的CD133 單克隆抗體、PE 標(biāo)記的CD34 單克隆抗體、PE 標(biāo)記的KDR 單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BioLegend 公司；TRI?zon 總RNA 提取劑、cDNA 第一鏈合成試劑盒、SYBR Green I 試劑盒、PCR 專用八連排管、定量RT-PCR 儀均購(gòu)自瑞士Roche 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、激光共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿購(gòu)自美國(guó)Corning公司；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher 公司；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO 公司；CKX41 型倒置相差顯微鏡購(gòu)自日本OLYMPUS公司；多波長(zhǎng)激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)LEICA公司。

1.2 方 法

1.2.1 人外周血淋巴細(xì)胞分離、培養(yǎng) 取健康成人外周血10 mL，經(jīng)人外周血淋巴細(xì)胞分離液離心，分為血漿層、淋巴細(xì)胞層、分離液層、紅細(xì)胞層，小心吸取淋巴細(xì)胞層，磷酸鹽緩沖液（phos?phate buffered saline，PBS）清洗3 遍后獲得人外周血淋巴細(xì)胞，將獲得的細(xì)胞移入載玻片中，并浸沒(méi)于EGM-2 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2 貼壁細(xì)胞雙熒光染色鑒定 取培養(yǎng)7 d的貼壁細(xì)胞，用PBS 洗滌后，貼壁細(xì)胞加入2.4 μg/mL Dil-ac-LDL 12 μg，置培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，經(jīng)PBS洗滌、甲醛固定后再加入10 μg/mL FITC-UEA-I 10 μL，孵育1 h，PBS 洗滌后用90%的甘油封片，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型 7 d 后用經(jīng)PBS洗滌，貼壁細(xì)胞以0.25%胰蛋白酶2 mL 消化5 min，加入10%胎牛血清2 mL 終止消化，PBS 反復(fù)沖洗培養(yǎng)孔，收集消化下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行離心，棄掉上清液，加PBS 稀釋計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 × 105/mL。與標(biāo)記的CD34、CD133、KDR 單克隆抗體在4℃孵育30 min，PBS 重復(fù)洗滌并重懸細(xì)胞，用細(xì)胞流式儀檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞分組、培養(yǎng) 取內(nèi)皮祖細(xì)胞重懸于EGM-2 培養(yǎng)基中，以2×105/mL 的濃度接種到鋪有3 種鈷鉻合金片膜的6 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，分別記為裸鈷鉻合金片組（裸金屬組），雷帕霉素藥物涂層鈷鉻合金片組（雷帕霉素組），復(fù)合羥丁基殼聚糖攜載CD133 抗體溫敏膜鈷鉻合金片組（抗體溫敏膜組）。

1.2.5 黏附及遷移能力測(cè)定 內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)7 d后經(jīng)胰蛋白酶消化，PBS 反復(fù)洗滌3 次后，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL。（1）黏附能力測(cè)定：取1 mL 接種在包被有人纖維連接蛋白的培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。再次經(jīng)PBS 洗滌后在顯微鏡下觀察，隨機(jī)取3 個(gè)視野（×200）計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞，結(jié)果取平均值。（2）遷移能力測(cè)定：取200 μL 細(xì)胞懸液加入transwell小室的上室，600 μL培養(yǎng)液加入下室，孵育24 h。取出transwell 小室，用PBS 洗滌，用棉簽擦去微孔膜上層的細(xì)胞，下層的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定10 min。細(xì)胞用Giemsa 染色后，在顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取3 個(gè)視野（×200），計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞，結(jié)果取平均值。

1.2.6 實(shí)時(shí)定量RT-PCR 收集細(xì)胞后，加入TRIzol混勻裂解細(xì)胞，經(jīng)氯仿抽提，異丙醇沉淀，提取細(xì)胞樣本中總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和濃度。用cDNA 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將RNA 模板、引物（eNOS 引物序列：For 5′-GTT TGT CTG GGG CCA TGT TA-3′ Rev 5′-GGG TGC GTA TGC GCC TTC TC-3′）、5×RT mix 和RNA 酶溶液溶解并置于冰上備用。先以RNA 為模板，在PCR 儀上37℃進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)15 min，85℃下5 s 使反轉(zhuǎn)錄酶失活，得到反轉(zhuǎn)錄的cDNA。向反應(yīng)管中加入反應(yīng)體系，將反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用GAPDH 為內(nèi)參引物（引物序列：For 5′-CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG-3′ Rev 5′-AGG CCA TGT GGG CCA TGAGG-3′），并設(shè)定PCR 儀反應(yīng)程序，預(yù)變性一個(gè)循環(huán)，反應(yīng)溫度為95℃15 min，擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)為45 次，擴(kuò)增循環(huán)的溫度為95℃10 s，退火溫度為60℃10 s，延伸溫度為72℃20 s，溶解曲線為一個(gè)循環(huán)數(shù)，溫度為95℃5 s，新增設(shè)置溫度65℃1 min。然后用凝膠電泳檢測(cè)反轉(zhuǎn)錄是否成功。采用2-△△Ct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)皮祖細(xì)胞的熒光鑒定結(jié)果

顯示紅色熒光的為ac-LDL陽(yáng)性細(xì)胞（圖1-1），顯示綠色熒光的為UEA-1 陽(yáng)性細(xì)胞（圖1-2），顯示雙熒光陽(yáng)性（黃色）的細(xì)胞被認(rèn)為是內(nèi)皮祖細(xì)胞（圖1-3）。

圖1 激光共聚焦顯微鏡示貼壁細(xì)胞吞噬Dil-ac-LDL 及FITC-UEA-I 的熒光顯色圖像（×200）

2.2 內(nèi)皮祖細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

培養(yǎng)7 d的細(xì)胞CD133表達(dá)率為（20.65±2.70）%，CD34表達(dá)率為（33.90±3.31）%，KDR表達(dá)率為（62.98±3.18）%（見(jiàn)圖2）。

圖2 培養(yǎng)7 d 貼壁細(xì)胞CD133、CD34、KDR 的表達(dá)率

2.3 3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞的生長(zhǎng)情況比較

新分離的細(xì)胞呈透亮圓形，接種后不久開(kāi)始貼壁，3 d 后出現(xiàn)集落，7 d 后細(xì)胞增大，接種于3 種金屬板上的內(nèi)皮祖細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，接種7 d 的內(nèi)皮祖細(xì)胞呈卵圓形（圖3-1、2、3），14 d 后分化良好，大部分呈長(zhǎng)梭形，小部分呈圓形（圖3-4、5、6），其中抗體溫敏膜祖細(xì)胞數(shù)量多于其他兩組。

圖3 內(nèi)皮祖細(xì)胞光學(xué)顯微鏡下圖像（1-3 依次為接種7 d 的裸金屬組、雷帕霉素組、抗體溫敏膜祖內(nèi)皮組細(xì)胞；4-6 依次為接種14 d 裸金屬組、雷帕霉素組、抗體溫敏膜組內(nèi)皮祖細(xì)胞；×200）

2.4 內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及黏附、遷移能力

抗體溫敏膜組接種7 d 的細(xì)胞個(gè)數(shù)較其余兩組高（P<0.01），根據(jù)黏附能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)、transwell小室法，抗體溫敏膜組細(xì)胞黏附個(gè)數(shù)較裸金屬組與雷帕霉素組高（P均<0.01），細(xì)胞遷移個(gè)數(shù)也較其余兩組高（P均<0.01），抗體溫敏膜組細(xì)胞的黏附能力及遷移能力較其余兩組增高，詳見(jiàn)表1。

表1 3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附、遷移能力比較 ［］

表1 3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞黏附、遷移能力比較 ［］

注：與裸金屬組比較，**P<0.01；與雷帕霉素組比較，1）**P<0.01

2.5 內(nèi)皮祖細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因的水平

定性定量檢測(cè)細(xì)胞表達(dá)的eNOS 基因的水平，PCR 儀示3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞的Ct 值及內(nèi)參校正后的△Ct?？贵w溫敏膜組內(nèi)皮祖細(xì)胞△Ct 值較裸金屬組與雷帕霉素組的△Ct 值低（P均<0.01），根據(jù)2-△△Ct公式［△△Ct=（目的基因Ct 值—內(nèi)參基因Ct值）實(shí)驗(yàn)組—（目的基因Ct 值—內(nèi)參基因Ct 值）對(duì)照組］計(jì)算可得出相對(duì)表達(dá)量，抗體溫敏膜組eNOS 基因含量是裸金屬組基因含量的2.43 倍，是雷帕霉素組基因含量的5.90 倍，詳見(jiàn)表2。

表2 3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞目的基因Ct 值及內(nèi)參校正△Ct 值比較 ［］

表2 3 組內(nèi)皮祖細(xì)胞目的基因Ct 值及內(nèi)參校正△Ct 值比較 ［］

注：與裸金屬組比較，**P<0.01；與雷帕霉素組比較，1）**P<0.01

3 討論

自1977 年德國(guó)的學(xué)者Gruentzig 成功完成世界第一例經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈球囊成形術(shù)后，冠心病血運(yùn)重建理念和治療方式發(fā)生了革命性的變化，至今，經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（percutaneous coronary inter?vention，PCI）治療已發(fā)展成為治療冠心病的常規(guī)方法。裸金屬支架時(shí)期的支架內(nèi)再狹窄率為20%～30%，藥物涂層支架的應(yīng)用使支架內(nèi)再狹窄率降至10%以下［8］。但近年來(lái)，伴隨著更多的復(fù)雜病變應(yīng)用藥物涂層支架，使支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率增加到10%以上［9］，這是目前支架面臨的亟待解決的問(wèn)題。

迄今為止，人們認(rèn)為藥物涂層支架內(nèi)發(fā)生再狹窄或血栓形成的機(jī)制如下。（1）血管再內(nèi)皮化延遲：支架在植入過(guò)程中，極易損傷血管內(nèi)皮，損傷的內(nèi)皮細(xì)胞使血小板黏附、聚集，形成血栓，而藥物涂層支架攜載的藥物，如雷帕霉素，在抑制平滑肌細(xì)胞增殖的同時(shí)也抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮化，使損傷部位難以愈合；（2）炎癥因子作用：支架置入初期，損傷的血管內(nèi)皮部位會(huì)聚集大量的單核細(xì)胞及T 細(xì)胞。各種炎性因子會(huì)促使白細(xì)胞趨化到損傷部位，導(dǎo)致炎性反應(yīng)。炎性反應(yīng)會(huì)增加血管壁的通透性，導(dǎo)致水腫，進(jìn)一步降低血管的橫截面積，血栓形成及細(xì)胞的聚集都會(huì)加重管腔狹窄。由此可見(jiàn)，內(nèi)皮受損是支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的始動(dòng)因素［10］，尤其在支架植入晚期，可以增加支架內(nèi)血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)。目前，臨床上通過(guò)延長(zhǎng)阿司匹林聯(lián)合氯吡格雷或替格瑞洛雙聯(lián)抗血小板的時(shí)間來(lái)預(yù)防晚期血栓的發(fā)生，但明顯增加了出血風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何加速血管內(nèi)皮的修復(fù)，降低再狹窄率，促使內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲支架的研究成為目前心血管病領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。本研究立足于該熱點(diǎn)，以內(nèi)皮祖細(xì)胞為突破口，探究羥丁基殼聚糖CD133+抗體溫敏膜對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、遷移能力。

目前，通常采用流式檢測(cè)CD34、CD133、KDR聯(lián)合熒光鑒定的方式來(lái)鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，本研究發(fā)現(xiàn)顯示紅色熒光的為ac-LDL 陽(yáng)性細(xì)胞，顯示綠色熒光的為UEA-1 陽(yáng)性細(xì)胞，顯示雙熒光陽(yáng)性（黃色）的細(xì)胞是內(nèi)皮祖細(xì)胞，且內(nèi)皮祖細(xì)胞中CD34、CD133、KDR 均有表達(dá)，但CD133 抗原是5 次跨膜的糖蛋白，特異性是最強(qiáng)的，高度保守，只在骨髓及外周血造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞中表達(dá)［11］。因此，CD133 為比較優(yōu)勢(shì)的抗體選擇，通過(guò)包被于支架表面，捕獲外周循環(huán)血中含CD133 抗原的內(nèi)皮祖細(xì)胞，使其貼服于支架表面，促進(jìn)其分化為內(nèi)皮細(xì)胞，加速再內(nèi)皮化的步伐，降低主要不良心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

支架涂層在整個(gè)支架中起到重要作用，良好的支架涂層必須具備以下特點(diǎn)：無(wú)毒性、良好的血液相容性、無(wú)凝血活性［12］。現(xiàn)有支架多采用聚乳酸等聚合物，長(zhǎng)期刺激血管，易造成支架周圍炎癥，在各種炎癥因子的刺激下，血管易發(fā)生完全晚期血栓，造成支架內(nèi)再狹窄［13］。因此，開(kāi)辟良好血液相容性的支架涂層也是對(duì)降低再狹窄極為有利的方式。殼聚糖化學(xué)名稱為β-（1，4）-2 脫氧-D-葡萄糖，其分子上攜帶一個(gè)堿性的胺基，因此不溶于中性和堿性環(huán)境，可溶于酸，具有良好的生物學(xué)相容性、血液相容性、無(wú)毒性、促進(jìn)傷口愈合、抗感染等特點(diǎn)，在醫(yī)療衛(wèi)生界得到廣泛應(yīng)用。而羥丁基殼聚糖是在殼聚糖的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行化學(xué)改進(jìn)，對(duì)比殼聚糖，其有溶于水的理化特性，并且抑菌能力也大大增強(qiáng)。羥丁基殼聚糖是一種可逆的水溶膠，有溫度和pH 敏感性［14］。其表面帶正電荷，可以自動(dòng)吸附帶負(fù)電的蛋白，便于細(xì)胞定植在涂層表面進(jìn)行攀爬、增殖，其分子所含的氨基葡萄糖可以與細(xì)胞表面的受體相互作用，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，在4個(gè)以上的氨基葡萄糖上表現(xiàn)尤其明顯。

本研究通過(guò)羥丁基殼聚糖攜載CD133 抗體溫敏膜與裸金屬組及雷帕霉素組相比，發(fā)現(xiàn)羥丁基殼聚糖攜載CD133 抗體溫敏膜能夠更好的促進(jìn)人外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的的生長(zhǎng)、遷移和黏附，具有良好的生物相容性和血液相容性，其eNOS 表達(dá)水平的增高，表示能促進(jìn)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)換，因此，羥丁基殼聚糖攜載CD133 抗體可以加速支架表面的內(nèi)皮化，降低血管的再狹窄率，有安全性及一定的經(jīng)濟(jì)效益，可作為一項(xiàng)新型支架材料服務(wù)于介入治療，造福于人類。