肖正中，凌文卿，蔡秋香，陳少珍，周文杰，鄔蘇曉

（韶關學院 英東生物與農業(yè)學院，廣東 韶關 512005）

糞腸球菌也稱糞鏈球菌，廣泛存在于人和動物腸道中，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中常作為益生菌使用［1］，同時也是一種重要的條件致病菌，能夠引起人和動物多個器官的感染［2-3］.近年來關于糞腸球菌感染的報道也越來越多［4-5］.由于抗生素的廣泛使用，許多糞腸球菌逐漸發(fā)展成為獲得耐藥性菌株，其所致感染較難控制，使得臨床藥物治療的難度越來越大，一些經(jīng)驗性的藥物治療很難充分發(fā)揮作用［6-8］，由此造成養(yǎng)豬生產(chǎn)中病死率增加的風險也逐步提高.本實驗旨在通過對豬源糞腸球菌的分離鑒定及分離株的藥物敏感性分析，為豬場臨床合理用藥提供參考，為動物源細菌耐藥性監(jiān)測提供數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品

豬直腸糞樣31 份，采集于粵北某豬場.

1.1.2 藥品與試劑

PSE 培養(yǎng)基、M-H 培養(yǎng)基、疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基均購自青島海博生物公司；PCR 相關試劑（Premix TaqTM、DNA DL2000 Maker、緩沖液等）購自TaKaRa 公司；藥敏試紙購自杭州天和微生物試劑有限公司.

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

以無菌棉拭子于豬肛門處采樣，接種于疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基，于37 ℃增菌培養(yǎng)12 h.

1.2.2 細菌分離培養(yǎng)

取增殖培養(yǎng)的菌液接種于PSE 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取黑色單菌落，接種于疊氮化鈉葡萄糖肉湯培養(yǎng)基中進行初次擴純培養(yǎng).將擴純培養(yǎng)的菌液劃線接種于PSE 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取黑色單菌落，再次進行純化培養(yǎng).

1.2.3 革蘭氏染色

取純化培養(yǎng)的細菌進行革蘭氏染色，于顯微鏡油鏡下觀察其染色特性及形態(tài)和排列.

1.2.4 PCR 鑒定

1.2.4.1 引物

糞腸球菌特異性轉錄調控基因Ef0027，由TaKaRa 公司合成，預擴增片段518 bp［9］.

P1：5′-GCCACTATTTCTCGGACAGC-3′；P2：5′-GTCGTCCCTTTGGCAAATAA-3′.

1.2.4.2 PCR 鑒定條件

采用煮沸法提取細菌基因組DNA，取上清作為DNA 模板.PCR 反應體系為25 μL：其中模板DNA 2 μL， PCR Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，加dd H2O 補至25 μL. PCR 擴增條件為：95 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 次循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min.反應完成后取5 μL PCR擴增產(chǎn)物，于濃度為1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測PCR 擴增結果.

1.2.5 藥敏試驗

選取取青霉素、諾氟沙星、頭孢曲松鈉等38 種抗生素，采用K-B 法對糞腸球菌分離株進行藥物敏感性試驗.參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）2018 標準對糞腸球菌耐藥性進行分析.

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)

31 份豬直腸糞樣于疊氮化鈉葡萄糖培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h 后，培養(yǎng)基呈均勻渾濁，將樣品培養(yǎng)菌液接種于PSE 瓊脂培養(yǎng)基，其中15 份樣品在PSE 瓊脂培養(yǎng)基上有棕黑色、圓形、邊緣光滑、表面濕潤、不透明疑似糞腸球菌菌落生成，挑取黑色疑似候選菌落進一步擴純培養(yǎng).

2.2 細菌革蘭氏染色

將分離擴純培養(yǎng)獲得的15 個疑似候選菌進行革蘭氏染色，結果呈陽性.在顯微鏡油鏡下觀察，菌體呈球形，以短鏈狀排列，無芽孢和莢膜，見圖1.

圖1 分離菌革蘭氏染色結果

2.3 PCR 鑒定

對15 個疑似候選菌落Ef0027 基因進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分別獲得3 條約518 bp的電泳條帶，與預期結果一致，見圖2.

圖2 分離菌株Ef0027 基因PCR 擴增結果

2.4 藥敏試驗

將PCR 鑒定陽性菌分別進行藥敏試驗，結果見表1.根據(jù)CLSI（2018）判定標準，3 株糞腸球菌對11類38 種藥物總耐藥率為69.3%，對頭孢克肟、羧芐西林、鏈霉素、林可霉素、四環(huán)素等17 種藥物均耐藥，占總藥物數(shù)的44.7%，其中分離菌株對磺胺類、林可胺類、苯丙醇類、四環(huán)素類、甲硝唑等藥物呈100%耐藥，對其它藥物的耐藥率分別為：頭孢類83.3%，大環(huán)內酯類77.8%，呋喃唑酮66.7%，青霉素類44.4%，氟喹諾酮類和氨基糖苷類41.7%，糖肽類33.3%.結果表明，由該豬場分離的糞腸球菌存在普遍耐藥情況，且多重耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象嚴重.

表1 糞腸球菌分離株藥敏試驗結果

3 討論

近年來，動物源糞腸球菌感染日益增多，臨床上耐藥菌株不斷出現(xiàn)，多重耐藥現(xiàn)象普遍，相關報道屢見不鮮，對動物性食品衛(wèi)生安全及人類公共衛(wèi)生安全構成了極大威脅［10-12］.此外，由于糞腸球菌還編碼眾多毒力基因，又增加了對該病臨床防治的困難［13］.本實驗從31 份豬直腸糞樣中分離到3 株糞腸球菌，分離率為9.8%，分離株總耐藥率為69.3%，耐藥率70%以上的抗菌素有磺胺類、林可胺類、苯丙醇類、四環(huán)素類、甲硝唑、頭孢類和大環(huán)內酯類，耐藥率40%左右的有青霉素類、氟喹諾酮類、糖肽類、氨基糖苷類及呋喃唑酮，分別占11 大類藥物的64.5%和45.5%，結果說明該豬源糞腸球菌對大多數(shù)抗菌藥呈高度耐藥，且多重耐藥和交叉耐藥現(xiàn)象嚴重，從而在一定程度上增加了豬場抗感染治療的難度.

糞腸球菌作為革蘭氏陽性菌耐藥的指示菌，其耐藥機制復雜，存在對某些抗菌藥物的固有耐藥性及獲得性耐藥，尤其是耐萬古霉素腸球菌（VRE）的快速增加使得VRE 成為臨床感染的重要病原菌［14-15］.萬古霉素常用于耐藥革蘭氏陽性菌的治療，隨著糖肽類藥物的大量使用，耐萬古霉素細菌出現(xiàn)并有增多趨勢，VRE 成為臨床重點關注的病原菌，其對細菌耐藥性檢測具有重要意義.本實驗發(fā)現(xiàn)，此次豬糞腸球菌分離株對萬古霉素的耐藥率為33.3%，說明該豬場細菌耐藥性問題異常嚴重，已經(jīng)出現(xiàn)了耐萬古霉素的糞腸球菌，應該引起豬場獸醫(yī)的重視.

細菌耐藥性的產(chǎn)生可能和臨床長期用藥習慣、用藥頻率及用藥方式等因素有關.因此，臨床用藥應參考藥敏試驗結果制定合理的給藥方案，合理選藥，正確用藥，持續(xù)進行耐藥性監(jiān)測并及時預警，及時調整，以延緩耐藥菌株出現(xiàn)，降低細菌耐藥性產(chǎn)生機率.

細菌耐藥性可通過耐藥基因在人和動物之間相互傳遞，糞腸球菌作為革蘭氏陽性菌耐藥的指示菌，對動物源糞腸球菌的耐藥性分析和研究具有重要意義［16-17］，因此進一步研究其耐藥表型和耐藥基因型之間的關系對研究糞腸球菌耐藥機制和臨床防治具有重要意義.