馬姝，趙沙沙,2，林玩福,2，汪懷周，程彬彬,2，翟笑楓,2，鄭國(guó)銀,2

（1.海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上海 200433；2.海軍軍醫(yī)大學(xué)中醫(yī)系，上海 200433）

馬齒莧為有名的“救荒本草”，具有清熱解毒、涼血消腫之功效，前期我們從馬齒莧的有效成分分離出馬齒莧總皂苷等物質(zhì)，并對(duì)其作用等進(jìn)行了系統(tǒng)研究[1-4]，對(duì)馬齒莧提取物的抗肝癌活性成分進(jìn)行初步篩選，并觀察到馬齒莧提取物體外對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有一定的抑制作用，同時(shí)其對(duì)裸鼠的體內(nèi)轉(zhuǎn)移也有抑制作用，能夠調(diào)節(jié)肺轉(zhuǎn)移及血液、肝組織等的物質(zhì)代謝。有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)在肝炎-肝硬化-肝癌不同的動(dòng)物模型中，血漿及肝組織的代謝物質(zhì)存在明顯的變化，其中有二氫鞘氨醇、棕櫚酰肉堿、膽汁酸衍生物等代謝標(biāo)記物[5-6]。在不同的肝癌模型中，馬齒莧的體內(nèi)代謝輪廓和產(chǎn)物又是如何呢？為此我們建立了人肝癌Huh7細(xì)胞裸鼠皮下瘤模型，擬從代謝組學(xué)水平上，探究馬齒莧在肝癌裸鼠皮下瘤模型中的代謝輪廓，本次研究擬動(dòng)態(tài)觀察馬齒莧在肝癌裸鼠皮下瘤模型不同時(shí)間段的尿液的代謝組學(xué)輪廓及變化情況，同時(shí)探尋貫穿始終的尿液代謝產(chǎn)物。

1 材料

1.1 藥物與試劑 馬齒莧配方顆粒（江陰天江藥業(yè)有限公司），其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)參考2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn)，由江陰天江藥業(yè)有限公司內(nèi)校質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，GZ-SOP0ZE405中藥配方顆粒取樣操作流程符合質(zhì)量規(guī)定。按照濃縮顆粒:生藥為1∶10的比例溫水調(diào)制成需要的藥物濃度，馬齒莧高劑量（20 g/mL）、馬齒莧低劑量（10 g/mL）。HPLC甲醇（德國(guó)Merck公司）；乙腈、甲酸、蒸餾水（德國(guó)Merck Dannstadt公司）；2-氯-苯丙氨酸（上海吉爾化有限公司）。

1.2 主要儀器 超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備儀器廠）；二氧化碳孵箱（德國(guó)Heraeus公司）；TSE型電熱保溫干燥箱（日本SNAYO公司）；脫色搖床（武漢Servicebio）；電子天平（德國(guó)Sartorius公司）；全自動(dòng)組織脫水浸蠟機(jī)（日本Tepsarvra公司）；2035型切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；ZMN-6803型自動(dòng)溫度控制漂片烤片儀（西安華利電子公司）；低溫離心機(jī)（美國(guó)Thermo fisher FRESCO17公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌Huh7細(xì)胞由上海長(zhǎng)海醫(yī)院中醫(yī)腫瘤實(shí)驗(yàn)室傳代保存，用含10% FBS（Fetal Bovine Serum）的高糖完全培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM），在37℃、5%CO2完全飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，視細(xì)胞情況進(jìn)行傳代。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C雄性裸鼠，約4周齡，體質(zhì)量18～20 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（滬）2015-0017。裸鼠飼養(yǎng)在上海長(zhǎng)海醫(yī)院的SPF級(jí)中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房，飼料同樣購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，墊料及籠具均由中心實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房提供，飼養(yǎng)所有用具均滅菌，用具通過輻照滅菌，飲用水為高壓高溫滅菌純凈水。實(shí)驗(yàn)中的干預(yù)藥物在輻照滅菌后進(jìn)入滅菌環(huán)境使用。本實(shí)驗(yàn)中的裸鼠均自由采食和飲水。本次研究經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 裸鼠皮下瘤模型 事先進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，待生長(zhǎng)平穩(wěn)后取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、狀態(tài)良好的Huh7細(xì)胞，進(jìn)行常規(guī)消化，離心后去除上清培養(yǎng)基，加入PBS重懸細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液2×107個(gè)/mL，每只裸鼠左下肢內(nèi)側(cè)皮下注射入200 μL細(xì)胞懸液。造模成功后隨機(jī)分為模型對(duì)照組、馬齒莧高劑量組、馬齒莧低劑量組，每組5只。另取未造模的裸鼠作為正常對(duì)照組。接種后第3天開始按照分組進(jìn)行干預(yù)。馬齒莧高、低劑量組裸鼠每日每只灌胃200 μL相應(yīng)濃度的馬齒莧溶液，模型對(duì)照組、正常對(duì)照組裸鼠灌胃200 μL無菌生理鹽水。分別于第7、14天通過代謝籠收集各組裸鼠的12 h尿液，3 000 r/min離心10 min，取上清液于-80℃冰箱中凍存待測(cè)，馬齒莧低劑量組、馬齒莧高劑量組、模型對(duì)照組、正常對(duì)照組樣品分別標(biāo)記為UMD、UMG、UM、UZ。

2.2 樣本預(yù)處理 本實(shí)驗(yàn)采集的尿液樣本在收集完后用移液槍吸取100 μL于1.5 mL EP管中。加入300 μL甲醇，并加入5 μL內(nèi)標(biāo)（2.8 mg/mL，2-氯苯丙氨酸）。渦旋混勻30 s，-20℃靜置1 h。置于4℃離心機(jī)中，12 000 r/min離心15 min。吸取200 μL上清，轉(zhuǎn)入進(jìn)樣小瓶中待檢測(cè)。

2.3 LC/MS分析 采用Thermo Ultimate 3000 LC液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流動(dòng)相為水+0.1%甲酸（A），乙腈+0.1%甲酸（B），流速為0.3 mL/min，柱溫為40°C，進(jìn)樣量為4 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為4°C。

2.4 質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù) 本實(shí)驗(yàn)過程中分別用正模式（ESI+）、負(fù)模式（ESI-）兩種模式進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。其中正模式具體參數(shù)：加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為45 arb，輔助氣流速為15 arb，尾氣流速為1 arb，電噴霧電壓為3.0 kV，毛細(xì)管溫度為350℃，S-Lens RF Level 30%。負(fù)模式具體參數(shù)：加熱器溫度為300℃，鞘氣流速為45 arb，輔助氣流速為15 arb，尾氣流速為1 arb，電噴霧電壓為3.2 kV，毛細(xì)管溫度為350℃，S-Lens RF Level 60%。

2.5 數(shù)據(jù)分析LC/MS檢測(cè)數(shù)據(jù)使用Compound Discoverer軟件（Thermo公司）進(jìn)行提取和預(yù)處理，其后在Excel 2010中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化及后期編輯，最后整理成二維數(shù)據(jù)矩陣形式，導(dǎo)入SIMCA-P 13.0（Umetrics AB，Umea，Sweden）軟件進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。采用有監(jiān)督式方法OPLS-DA（正交偏最小二乘法）進(jìn)行建模分析，組間明顯沿t[1]軸分開，提示組間差異明顯。模型的參數(shù)R2X表示有多少變量作為主要成分構(gòu)造模型，參數(shù)Q2表示模型的預(yù)測(cè)率、R2Y表示模型的解釋率。OPLS-DA得分圖中的點(diǎn)距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)其VIP（Variable Importance in the Projection）值越大，代謝產(chǎn)物的差異越明顯。對(duì)模型的貢獻(xiàn)率也越大（閾值＞1）。結(jié)合t-test的P值來尋找差異性表達(dá)代謝物。篩選差異性表達(dá)代謝物標(biāo)準(zhǔn)：VIP值＞1的變量，同時(shí)進(jìn)行t-test檢驗(yàn)（P＜0.05）。

3 結(jié) 果

3.1 馬齒莧對(duì)肝癌皮下瘤模型的瘤體抑制情況 正常對(duì)照組沒有腫瘤，馬齒莧高、低劑量組與模型對(duì)照組有腫瘤，其腫瘤大小見圖1A，馬齒莧高、低劑量組的瘤體體積小于模型對(duì)照組，并且馬齒莧高劑量組的瘤質(zhì)量明顯低于模型對(duì)照組（P＜0.05），表明馬齒莧能抑制肝癌裸鼠皮下瘤的生長(zhǎng)。（見圖1）

圖1 各組裸鼠瘤體情況比較（±s，n=5）

3.2 第7 天尿液代謝結(jié)果分析

3.2.1 PCA分析 對(duì)4組尿液進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)在正模式下共獲得5個(gè)主成分，累積R2X=0.615，Q2=0.159；負(fù)模式下共獲得4個(gè)主成分，累積R2X=0.568，Q2=0.223。PCA得分圖（Scores plot）見圖2～3。

圖2 第7天4組尿液的PCA得分圖（ESI+）

圖3 第7天4組尿液的PCA得分圖（ESI-）

3.2.2 PLS-DA分析 采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計(jì)方法，也就是最小二乘方判別分析（PLS-DA）對(duì)4組樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得導(dǎo)致這種顯著差異的代謝物信息。發(fā)現(xiàn)在正模式下，其模型質(zhì)量參數(shù)具有2個(gè)主成分，R2X=0.28，R2Y=0.429，Q2=-0.018 5；在負(fù)模式下其模型質(zhì)量參數(shù)具有2個(gè)主成分，R2X=0.283，R2Y=0.422，Q2=-0.21。本次4組數(shù)據(jù)未出現(xiàn)“過擬合”現(xiàn)象，說明模型能較好的描述樣本，并可作為模型生物標(biāo)記物群尋找的依據(jù)。（見圖4～5）

圖4 第7天4組尿液的PLS-DA得分圖及排序驗(yàn)證圖（ESI+）

3.2.3 OPLS-DA分析 在有監(jiān)督式方法OPLS-DA進(jìn)行建模分析，結(jié)果正模式下得到2個(gè)主成分和1個(gè)正交成分，R2X=0.385，R2Y=0.553，Q2=0.077 3；負(fù)模式下得到3個(gè)主成分和1個(gè)正交成分，R2Y=0.494，R2Y=0.77，Q2=0.119，模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)率。4組的模型能較好地描述樣本，并可作為模型生物標(biāo)記物群尋找的前提。（見圖6～7）

圖5 第7天4組尿液的PLS-DA得分圖及排序驗(yàn)證圖（ESI-）

圖6 第7天4組尿液的OPLS-DA得分圖（ESI+）

圖7 第7天4組尿液的OPLS-DA得分圖（ESI-）

3.2.4 第7 天4組尿液差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定VIP（Variable Importance in the Projection）（閾值＞1）是OPLS-DA模型的變量重要性投影值，可以結(jié)合t-test的P值（P＜0.05）來尋找差異性表達(dá)代謝物。差異性代謝物的定性尋找方法主要通過搜索在線數(shù)據(jù)庫(kù)（Metlin）（比較質(zhì)譜的質(zhì)荷比m/z或者精確分子質(zhì)量mass），差異性代謝物數(shù)據(jù)見表1，可見在第7天，馬齒莧高劑量組、馬齒莧低劑量組、模型對(duì)照組和正常對(duì)照組裸鼠尿液的代謝產(chǎn)物存在差異，其中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的有17種。

表1 第7天4組尿液差異性代謝產(chǎn)物表

3.3 第14 天尿液代謝結(jié)果分析

3.3.1 PCA分析 我們對(duì)UZ14組、UM14組、UMG14組及UMD14組進(jìn)行主成分分析，本分析在正模式下共獲得4個(gè)主成分，累積R2X=0.669，Q2=0.214；負(fù)模式下共獲得4個(gè)主成分，累積R2X=0.671，Q2=0.341。PCA得分圖（Scores plot）見圖8～9。

圖8 第14天4組尿液的PCA得分圖（ESI+）

3.3.2 PLS-DA分析 采用監(jiān)督性的多維統(tǒng)計(jì)方法，也就是最小二乘方判別分析（PLS-DA）對(duì)4組樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以獲得導(dǎo)致這種顯著差異的代謝物信息。其模型質(zhì)量參數(shù)為：在正模式下，具有2個(gè)主成分，R2X=0.297，R2Y=0.489，Q2=0.234；負(fù)模式下5個(gè)主成分，R2X=0.696，R2Y=0.861，Q2=0.452。正模式下，模型對(duì)于解釋兩組之間差異及尋找差異物質(zhì)是不可靠的，因此不宜利用此數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析；負(fù)模式下，模型對(duì)于解釋兩組之間差異及尋找差異物質(zhì)是可靠的，且從排序驗(yàn)證圖來看模型不存在“過擬合”現(xiàn)象，因此可利用此數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)分析。（見圖10～11）

圖9 第14天4組尿液的PCA得分圖（ESI-）

圖10 第14天4組尿液的PLS-DA得分圖及排序驗(yàn)證圖（ESI+）

圖11 第14天4組尿液的PLS-DA得分圖及排序驗(yàn)證圖（ESI-）

3.3.3 OPLS-DA分析 在選用OPLS-DA監(jiān)督式方法進(jìn)行進(jìn)一步建模分析發(fā)現(xiàn)，在正模式下得到2個(gè)主成分和0個(gè)正交成分，R2X=0.291，R2Y=0.494，Q2=0.261；而負(fù)模式下得到2個(gè)主成分和2個(gè)正交成分，R2X=0.636，R2Y=0.611，Q2=0.378，模型的參數(shù)R2Y表示模型的解釋率，Q2表示模型的預(yù)測(cè)率。（見圖12～13）

圖12 第14天4組尿液的OPLS-DA得分圖（ESI+）

圖13 第14天4組尿液的OPLS-DA得分圖（ESI-）

3.3.4 第14 天4組尿液差異性代謝產(chǎn)物的挖掘及鑒定 差異性代謝物數(shù)據(jù)鑒別方法同前，第14天4組出現(xiàn)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的代謝產(chǎn)物鑒定出來的共有43種。（見表2）

表2 第14天4組尿液差異性代謝產(chǎn)物表

3.4 第7 天和第14天共同出現(xiàn)的差異性代謝產(chǎn)物 通過對(duì)比第7天和第14天尿液代謝產(chǎn)物的差異發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過馬齒莧干預(yù)后，第14天尿液中代謝產(chǎn)物明顯增多，而其中有11種在第7天和第14天均出現(xiàn)，提示這11種代謝產(chǎn)物可能在肝癌裸鼠皮下瘤模型中有特殊的意義。11種代謝產(chǎn)物為吡啶甲酸、順式粘酸、對(duì)羥基苯乙酸、己基甘氨酸、3-磷酸甘油、3-羥基十四烷二酸、吡哆胺、3-羥基吡啶甲酸、酪醇、二氫胸腺嘧啶、黃尿酸。（見表3）

表3 第7天和第14天4組尿液共同的差異性代謝產(chǎn)物

4 討 論

肝癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，具有預(yù)后兇險(xiǎn)、病死率高等特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)時(shí)常為晚期[7-8]，因此針對(duì)肝癌早期診斷，以及療效評(píng)價(jià)的代謝標(biāo)志物的研究有深遠(yuǎn)意義。通過代謝組學(xué)研究代謝產(chǎn)物，篩查肝癌潛在的生物標(biāo)志物，可能為一種較好的肝癌診斷方法。目前已有較多對(duì)肝癌相關(guān)代謝產(chǎn)物的研究，涉及到的標(biāo)本有尿液、糞便、組織等。眾多學(xué)者運(yùn)用代謝組學(xué)探尋肝癌生物學(xué)標(biāo)志物[9]，本課題組長(zhǎng)期致力于中醫(yī)藥防治肝癌的研究，先后研究了不同肝癌證候的代謝組學(xué)物質(zhì)的差異，同時(shí)對(duì)常用中藥馬齒莧等的抗腫瘤的代謝作用也進(jìn)行了探索，體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)馬齒莧提取物具有抗炎、抗腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)免疫的作用，并可以調(diào)節(jié)肝癌動(dòng)物血液氨基酸類、脂肪酸類、有機(jī)酸物質(zhì)相關(guān)的體內(nèi)代謝發(fā)揮抑制肝癌轉(zhuǎn)移的作用[11-12]。

此次研究用人肝癌Huh7細(xì)胞建立裸鼠皮下瘤模型，在代謝組學(xué)水平上，探究馬齒莧對(duì)該模型尿液代謝組學(xué)的影響，以明確馬齒莧抗肝癌的作用及其機(jī)制。本次實(shí)驗(yàn)采用LC/MS儀器對(duì)裸鼠尿液樣本進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)尿液樣本中這些物質(zhì)的峰的響應(yīng)強(qiáng)度數(shù)據(jù)進(jìn)行模型判別分析，進(jìn)行OPLS-DA的模型構(gòu)建，從而獲得差異性表達(dá)代謝物。代謝組學(xué)結(jié)果顯示，第7天鑒別出4組之間的代謝產(chǎn)物有17種，第14天4組之間的代謝產(chǎn)物有43種，其中有11種差異物質(zhì)在第7天和第14天均有，為吡啶甲酸、順式粘酸、對(duì)羥基苯乙酸、己基甘氨酸、3-磷酸甘油、3-羥基十四烷二酸、吡哆胺、3-羥基吡啶甲酸、酪醇、二氫胸腺嘧啶、黃尿酸。在這11種共同代謝產(chǎn)物中，吡啶甲酸、3-磷酸甘油與腫瘤糖酵解過程中糖類代謝有關(guān)；順式粘酸、3-羥基十四烷二酸與機(jī)體脂類代謝密切相關(guān)；羥基苯乙酸、黃尿酸與腫瘤相關(guān)的酪氨酸代謝相關(guān)，前者對(duì)酪氨酸酶單酚酶具有抑制作用，己基甘氨酸與腫瘤的發(fā)生、抗炎和免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)；吡哆胺、黃尿酸為維生素B6代謝通路；二氫胸腺嘧啶則為嘧啶的代謝產(chǎn)物，在腫瘤組織中含量升高。

有氧糖酵解是惡性腫瘤的重要標(biāo)志。肝癌在導(dǎo)致肝細(xì)胞不受限制的無限增殖之后，便開始放緩發(fā)展速度，之后在HCC細(xì)胞中觀察到最常見的代謝現(xiàn)象就是糖酵解速率的增加，這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)。研究證實(shí)糖酵解基因的高表達(dá)與肝癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的升高確有相關(guān)，糖酵解酶可能是關(guān)于HCC預(yù)防的一個(gè)潛在靶點(diǎn)，糖酵解與PPP都是異常肝細(xì)胞增殖必須的代謝行為。本次研究中從裸鼠的尿液代謝產(chǎn)物中所鑒別出的3-磷酸甘油是糖酵解環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵產(chǎn)物。吡啶甲酸是一種重要的中間體，為異煙酸、煙酸、2-吡啶甲酸的前體，其中煙酸參與了人體組織的氧化還原過程，具有促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝的功能，2-吡啶甲酸是一種重要的有機(jī)合成中間體，由其制備的吡啶甲酸鉻可以調(diào)節(jié)血糖和胰島素，在腫瘤中參與糖酵解過程中糖類代謝[10]。

酪氨酸代謝異常在腫瘤發(fā)生發(fā)展中普遍存在，人們逐漸發(fā)現(xiàn)新生血管對(duì)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，抗血管生成已經(jīng)成為腫瘤治療的重要手段，肝癌是一種血管豐富的實(shí)體性惡性腫瘤，研究證實(shí)酪氨酸在肝癌患者體內(nèi)明顯升高。研究者對(duì)20名健康志愿者和23例HCC患者的血漿進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，L-酪氨酸明顯升高[13]。在本次研究中，觀察到在第7天和第14天，裸鼠體內(nèi)的酪氨酸，以及與酪氨酸代謝相關(guān)的代謝產(chǎn)物羥基苯乙酸也存在異常，羥基苯乙酸對(duì)酪氨酸酶單酚酶具有抑制作用。順式粘酸為苯甲酸的兒茶酚鄰位裂解（orthocleavage）途徑產(chǎn)生，是一種潛在的平臺(tái)化合物，兒茶酚具有抗腫瘤血管生成的作用。

一項(xiàng)基于LC-MS的大規(guī)模代謝組分析技術(shù)納入了1 448例受試者的多中心研究，鑒定和驗(yàn)證了一組新型的肝癌組合代謝標(biāo)志物：甘氨酸膽酸、苯丙酰色氨酸。大規(guī)模臨床驗(yàn)證結(jié)果顯示，該組合標(biāo)志物能夠有效地在高風(fēng)險(xiǎn)的肝硬化人群中發(fā)現(xiàn)肝癌患者，其受試者操作特征曲線下面積（AUC）達(dá)到0.807～0.930，優(yōu)于傳統(tǒng)的肝癌臨床標(biāo)志物甲胎蛋白（AFP）的0.650～0.725，同時(shí)與AFP具有較好的互補(bǔ)性。本次實(shí)驗(yàn)中的己基甘氨酸，作為甘氨酸膽酸的前體，在裸鼠的尿液代謝中存在著異常[14]。

氧化應(yīng)激能夠促進(jìn)肝癌多倍體細(xì)胞的出現(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪肝的肝臟細(xì)胞的病理性多倍體化，主要由于細(xì)胞周期停滯在S/G2期，抗氧化應(yīng)激能夠使細(xì)胞重回生理性多倍體狀態(tài)[15]。既往研究顯示維生素B6（吡哆醇）具有很強(qiáng)的抗氧化作用[16]。外源性給予維生素B6可以明顯抑制大鼠肝癌細(xì)胞、人類和小鼠腫瘤細(xì)胞。研究者將33例原發(fā)性肝癌患者隨機(jī)分為安慰劑組（n=16）和維生素B650 mg/d（n=17）組，干預(yù)12周后。測(cè)定血漿5'-磷酸吡哆醛、同型半胱氨酸、氧化應(yīng)激指標(biāo)和抗氧化能力。維生素B6組血漿同型半胱氨酸在第12周顯著降低，對(duì)于新近接受腫瘤切除術(shù)的肝癌患者，補(bǔ)充維生素B6可能通過降低血漿同型半胱氨酸來調(diào)節(jié)抗氧化能力，而不是具有直接的抗氧化作用。本次研究中，裸鼠尿液中的吡哆胺、黃尿酸為維生素B6代謝通路中主要物質(zhì)，提示馬齒莧可能通過維生素B6代謝途徑，來調(diào)節(jié)抗氧化能力。尿液代謝中的3-羥基十四烷二酸屬于長(zhǎng)鏈脂肪酸類有機(jī)化合物，由脂肪酸通過歐米伽氧化和不完全β氧化結(jié)合而形成的[17]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血漿中的二氫胸腺嘧啶的含量高于正常人群。因此，血漿中二氫胸腺嘧啶的含量可作為結(jié)直腸癌標(biāo)志物，可用于結(jié)直腸癌診斷，判斷藥物治療結(jié)直腸癌患者是否有效或判斷結(jié)直腸癌患者的預(yù)后情況。嘧啶的代謝產(chǎn)物在腫瘤組織中含量升高。

馬齒莧為臨床常用藥[18]，可以通過影響肝癌體內(nèi)糖酵解，具有調(diào)節(jié)酪氨酸、己基甘氨酸等腫瘤相關(guān)氨基酸的代謝及抗氧化應(yīng)激的作用，可調(diào)節(jié)嘧啶等的尿液代謝來發(fā)揮其抑制肝癌的作用，為馬齒莧應(yīng)用于肝癌治療提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本課題仍有不足之處，鑒于前期馬齒莧對(duì)肝癌的療效作用已經(jīng)明確，且目前沒有確切有效的陽(yáng)性對(duì)照藥，本課題采用了空白對(duì)照和模型對(duì)照為研究方法，重點(diǎn)揭示馬齒莧在正常和肝癌裸鼠體內(nèi)的代謝輪廓。由于篇幅所限，馬齒莧其他時(shí)間點(diǎn)的尿液代謝及血液、肝臟物質(zhì)的代謝，我們將另行表述。為了提高本次實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)尿液代謝中有差異的生物標(biāo)志物的可行性，后續(xù)我們可以通過加大樣本量或選用更多的時(shí)間節(jié)點(diǎn)和不同的標(biāo)本類別等進(jìn)行靶向代謝組學(xué)的檢測(cè)研究及其他更深入的探索，為科學(xué)揭示馬齒莧在肝癌體內(nèi)代謝的輪廓提供一個(gè)多方位的佐證。非靶向代謝組學(xué)只是一種檢測(cè)有效代謝產(chǎn)物的方法，單一組學(xué)的數(shù)據(jù)在揭示生命體生理活動(dòng)的變化機(jī)制方面不夠全面，可以根據(jù)這些代謝物及其代謝途徑歸屬，并結(jié)合已有的基因和蛋白質(zhì)知識(shí)進(jìn)行多組學(xué)整合及多平臺(tái)整合分析。