高蘭天，周忠志

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007）

糖尿病足（diabetic foot，DF）是因神經(jīng)病變而失去感覺和因缺血而失去活力，合并感染而引起的足潰瘍，是糖尿病常見慢性并發(fā)癥之一[1]。糖尿病足發(fā)生后創(chuàng)面難以愈合，甚至進一步惡化，有截肢的風險，嚴重地影響了患者的生活質(zhì)量[2]。國外流行病學資料表明，在所有非外傷性低位截肢手術(shù)中，糖尿病患者占40%～60%[3]；在糖尿病相關(guān)的低位遠端截肢中，有85%發(fā)生在足部潰瘍后[4]。糖尿病足潰瘍創(chuàng)面能否有效處理對疾病的轉(zhuǎn)歸非常重要。目前對糖尿病足創(chuàng)面的處理尚無十分有效而統(tǒng)一的標準，而中醫(yī)藥外用制劑在此方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。我院根據(jù)中醫(yī)藥外治法及其遣方組成的象皮生肌膏具有祛腐生肌，活血止痛的功效，治療糖尿病足潰瘍收效良好[5]。本研究將象皮生肌膏用于糖尿病皮膚潰瘍大鼠，通過觀察創(chuàng)面組織切片、檢測相關(guān)指標和評價創(chuàng)面愈合情況，初步探討象皮生肌膏促糖尿病潰瘍愈合的療效及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級健康SD雄性大鼠36只，體質(zhì)量250～300 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2009-0004。均飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級，溫度維持在20～25℃，動物分籠飼養(yǎng)，飼以標準飼料，自由飲水，隔日更換墊料、消毒籠具。所有的大鼠飼養(yǎng)與操作均經(jīng)過湖南省實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 象皮生肌膏藥物組成：象皮粉120 g、當歸100 g、生地黃120 g、血余炭80 g、爐甘石200 g、生石膏150 g、龜甲120 g，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科自制（批號：20190818）；鏈脲佐菌素（STZ）（美國Sigma公司，批號：SZ0120）；檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（天津百倫斯生物技術(shù)有限公司，批號：PH1716）；水合氯醛（天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：191S09R23)；酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（上海恒遠生物科技有限公司，批號：CK5441Y）；ELIVISON試劑盒（PV-9000，批號：FO206-546U）和DAB酶底物顯色試劑盒（批號：I30046）（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀（美國Lab Vision公司）；光學顯微鏡（日本CARTON公司）；Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.4 造模與分組

1.4.1 糖尿病模型的建立[6]36只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。隨機取24只大鼠給予高脂高糖飼料（飼料配置：20.0%豬油+10.0%蔗糖+2.5%膽固醇+1.0%膽酸鹽+66.5%常規(guī)飼料）喂養(yǎng)2周，造模前大鼠禁食12～16 h，稱重后臨時用0.5 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5）配制1%（質(zhì)體比）STZ溶液，按45 mg/kg進行腹腔注射（僅注射一次即可）。72 h后每天07:00:00監(jiān)測血糖，若連續(xù)3次血糖濃度均＞16.7 mmo1/L，即視為糖尿病模型造模成功。其余12只大鼠腹腔一次性注射等體積不含STZ的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。

1.4.2 動物分組 造模成功后的24只糖尿病大鼠隨機分為模型組（12只）、治療組（12只）。12只未造模大鼠為正常組。

1.4.3 皮膚損傷模型的建立[7]觀察14 d后將所有大鼠建立皮膚損傷模型。腹腔注射適量4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）麻醉大鼠，將其背部毛發(fā)使用電推工具剪短后，再涂抹6%硫酸鈉溶液用來除掉毛發(fā)，毛發(fā)溶解后迅速使用清水沖洗；消毒大鼠背部皮膚在大鼠脊柱正中肩胛骨下緣水平線下2 cm切除一塊2cm×2cm全層皮膚，可見深筋膜存在。

1.5 實驗給藥 各組大鼠造模后次日開始藥物干預(yù)，治療組生理鹽水清洗潰瘍部位后，象皮生肌膏外敷并用醫(yī)用紗布覆蓋固定；模型組和正常組僅用生理鹽水清洗潰瘍部位后醫(yī)用紗布覆蓋固定。每隔24 h予以創(chuàng)面換藥處理，每2 d監(jiān)測一次血糖。

1.6 觀察指標 藥物干預(yù)第14天時觀察大鼠潰瘍創(chuàng)面，麻醉后切取創(chuàng)面周圍1 cm組織，觀察組織病理學、免疫組化、VEGF指標。藥物干預(yù)第21天，將大鼠脫頸椎法處死后切取創(chuàng)面周圍1 cm組織，檢測各組VEGF含量。

1.6.1 病理學檢查 切取的標本10%甲醛固定，HE染色，石蠟包埋切片。HE染色：將切片蘇木精液染色5 min，水洗5 min，1%的鹽酸乙醇分化30 s，水洗20 s，蒸餾水過洗10 s。入伊紅液中染色2 min，蒸餾水過洗10 s。再將切片依次放入95%乙醇（Ⅰ）1 min、95%乙醇（Ⅱ）1 min、無水乙醇（Ⅰ）3 min、無水乙醇（Ⅱ）3 min、二甲苯（Ⅰ）5 min、二甲苯（Ⅱ）5 min中脫水透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡觀察組織病理學改變情況。

1.6.2 免疫組織化學 常規(guī)石蠟包埋切片，采用LAB VISION 2D全自動免疫組化染色儀，EnVision二步法染色，光學顯微鏡下觀察新生血管情況。

1.6.3 酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng) 將切取的標本充分研碎制備勻漿，以2 000 r/min速度離心10 min，吸取上清液，采用ELISA法測定組織中VEGF含量，嚴格按照說明書方法操作。

1.6.4 創(chuàng)面愈合肉眼觀察 觀察并記錄3組大鼠藥物干預(yù)后3、7、14、21 d創(chuàng)面愈合情況。創(chuàng)面愈合時間，即創(chuàng)面模型建立至創(chuàng)面完全上皮化、閉合的時間。數(shù)碼相機照相后，采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測量創(chuàng)面面積，按以下公式計算創(chuàng)面閉合率。創(chuàng)面閉合率=（創(chuàng)面初始面積-創(chuàng)面形成后第n天的面積）/創(chuàng)面初始面積×100%。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料采用“均數(shù)±標準差”（±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK q檢驗，不同時間點的比較采用重復(fù)測量方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠成模情況 糖尿病皮膚潰瘍大鼠造模24只，一次成功造模24只，造模成功率100%。造模成功后大鼠隨機血糖＞16.7 mmoL/L，疲乏，消瘦，活動下降，毛發(fā)干枯、稀疏，多飲多尿。

2.2 各組大鼠皮膚潰瘍組織病理觀察 藥物干預(yù)第14天時，正常組大鼠皮膚表皮層細胞排列整齊，顆粒層清晰可見，真皮層及皮膚附件結(jié)構(gòu)、形態(tài)良好；模型組大鼠表皮細胞有變性改變，細胞結(jié)構(gòu)不清，核濃縮，表皮和表皮下層結(jié)構(gòu)松散；治療組大鼠表皮細胞排列基本整齊，顆粒層可見，真皮層及皮膚附件結(jié)構(gòu)清晰。（見圖1）

圖1 各組大鼠皮膚潰瘍組織HE染色圖（×400）

2.3 各組大鼠皮膚潰瘍組織免疫組織化學染色觀察 藥物干預(yù)第14天時，正常組大鼠皮膚潰瘍組織結(jié)構(gòu)清晰，有較多具有成熟管腔結(jié)構(gòu)的新生血管形成；模型組大鼠皮膚潰瘍組織結(jié)構(gòu)松散，細胞變性，新生血管較少且細??；治療組大鼠皮膚潰瘍組織結(jié)構(gòu)基本清晰，具有成熟管腔結(jié)構(gòu)的新生血管較粗，清晰可見。（見圖2）

圖2 各組大鼠皮膚潰瘍組織免疫組化染色圖（×400）

2.4 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF表達情況 治療組和模型組大鼠干預(yù)后14、21 d皮膚潰瘍組織VEGF含量低于正常組（P＜0.05）。治療組干預(yù)后14、21 d皮膚潰瘍組織VEGF均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF含量比較（±s，μg/g）

表1 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF含量比較（±s，μg/g）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 第14天 第21天正常組 12 49.43±4.44 45.83±3.56模型組 12 14.94±2.40a 11.07±2.62a治療組 12 38.51±4.41a b 20.14±3.37a b F 148.08 271.56 P 0.00 0.00

2.5 各組大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合情況 正常組大鼠干預(yù)后3 d創(chuàng)面縮小，有肉芽組織長出；干預(yù)后7 d創(chuàng)面明顯縮小，肉芽組織新鮮，血運良好；干預(yù)后14 d創(chuàng)面趨于閉合，干預(yù)后21 d創(chuàng)面完全閉合。模型組大鼠干預(yù)后出現(xiàn)創(chuàng)面擴大，肉芽組織生長緩慢，色暗，創(chuàng)面滲出明顯，愈合緩慢。治療組藥物干預(yù)后亦出現(xiàn)創(chuàng)面擴大，但3 d后創(chuàng)面開始縮小，肉芽組織生長得到改善，創(chuàng)面閉合加快，但未達正常組水平。3組大鼠創(chuàng)面閉合率比較，治療組和模型組大鼠干預(yù)后3、7、14、21 d創(chuàng)面閉合率均低于正常組（P＜0.05）；治療組干預(yù)3 d時與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），干預(yù)后第7、14、21天創(chuàng)面閉合率明顯高于模型組（P＜0.05）。（見表2、圖3）

表2 各組大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面閉合率比較（±s，%）

表2 各組大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面閉合率比較（±s，%）

注：F時間主效應(yīng)=1 877.80，P時間主效應(yīng)=0.00；F分組主效應(yīng)=54.48，P分組主效應(yīng)=0.00；F交互效應(yīng)=32.51，P交互效應(yīng)=0.00；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 3 d 7 d 14 d 21 d F P正常組 12 12.92±4.28 56.02±7.68 -1.56±2.04a 13.67±3.12a 90.04±4.15 100.00±0.00 36.25 0.00模型組 12 40.84±5.42a 60.90±6.23a 19.17 0.00治療組 12 4.23±2.25a 31.42±4.50ab 65.02±5.61ab 81.49±5.73ab 17.08 0.00 F 16.98 45.75 69.77 48.06 P 0.00 0.00 0.00 0.00

圖3 各組大鼠皮膚潰瘍創(chuàng)面閉合率交互效應(yīng)輪廓圖

3 討 論

隨著人類生活習慣和作息規(guī)律的改變，代謝性疾病日趨增多，也越來越受到國內(nèi)外學者的關(guān)注。糖尿病是代謝性疾病中較為常見的一種，常導(dǎo)致全身性病變，以血管和神經(jīng)病變尤甚[8]。其中糖尿病皮膚潰瘍是糖尿病中最嚴重的并發(fā)癥之一，具有較高的致殘率和死亡率[9]。糖尿病患者大血管及小血管由于長期處于高糖環(huán)境，導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損，大血管管腔變窄，遠端供血不足；小血管瘀滯，微循環(huán)障礙，加重組織缺血缺氧，導(dǎo)致創(chuàng)面無法得到有效而及時的修復(fù)[10]。其特點為愈合能力低下，愈合延遲，甚至不愈合。創(chuàng)面修復(fù)不僅依賴于上皮細胞和成纖維細胞增殖分化，爬行覆蓋創(chuàng)面，還依賴于內(nèi)皮細胞增殖分化后形成新生血管[11]。研究顯示，高糖環(huán)境將導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞和內(nèi)皮細胞功能受損，導(dǎo)致?lián)p傷血管不能得到修復(fù)，創(chuàng)傷后新生血管難以形成，故創(chuàng)面不能得到修復(fù)[12]。

我院藥物制劑中心生產(chǎn)的象皮生肌膏是在張山雷《瘍科綱要》記載的象皮生肌膏原方基礎(chǔ)上對其藥物配伍及藥量進一步化裁，結(jié)合現(xiàn)代制膏工藝加以改進而制成[13]。象皮生肌膏屬生肌類中藥制劑，其藥物組成包括象皮粉、當歸、生地黃、血余炭、爐甘石、生石膏、龜甲。其中象皮粉具有斂瘡止血的功效；當歸具有補血活血、消腫排膿、止痛生肌的功效；生地黃具有清熱涼血、生津滋陰的功效；血余炭具有消瘀止血的功效；爐甘石具有解毒收濕、止癢斂瘡的功效；生石膏具有清熱解毒瀉火的功效；龜甲具有滋陰潛陽、壯骨養(yǎng)血的功效。諸藥合用具有清熱活血、散瘀止痛、斂瘡生肌的作用，既根除外在病灶之標，又兼顧充實其本，以調(diào)節(jié)體內(nèi)氣血陰陽，達祛腐斂瘡生肌的目的。目前象皮生肌膏在慢性皮膚潰瘍、植皮/皮瓣術(shù)后殘余創(chuàng)面、糖尿病足、外傷性皮膚缺損、肛瘺術(shù)后創(chuàng)面換藥時療效確切[14]。象皮生肌膏屬純中藥制劑有無疼痛、無刺激、無腐蝕特點，具有較強的祛腐生肌長皮的作用。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，象皮生肌膏用于糖尿病足換藥能明顯改善創(chuàng)面血運，促進創(chuàng)面愈合[5]。

創(chuàng)面修復(fù)的速率與新生血管長入的速率呈正相關(guān)，因新生血管能提供修復(fù)所需要的營養(yǎng)成分和氧，從而促進上皮細胞和成纖維細胞增殖分化[15]。本實驗在糖尿病大鼠背部皮膚制備皮膚缺損潰瘍模型，表現(xiàn)為創(chuàng)面正常組織結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，符合糖尿病慢性創(chuàng)面的組織病理學特征。臨床治療中改善糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的血運是治療關(guān)鍵，創(chuàng)面組織細胞供血供氧得到保證，方能發(fā)揮其正常的增殖分化功能。從本實驗中HE染色結(jié)果可見治療組中象皮生肌膏通過改善糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面的供血供氧，使得創(chuàng)面中凋亡和變性的細胞減少，細胞的組織形態(tài)接近正常組。處于高糖環(huán)境下受損的組織細胞的形態(tài)能恢復(fù)接近正常，才能使其發(fā)揮正常的生理功能。治療組大鼠在第14天和第21天VEGF含量明顯高于模型組，且第14天時治療組大鼠新生的血管明顯多于模型組，可見象皮生肌膏能明顯促進內(nèi)皮細胞分泌VEGF，從而加速血管的新生。VEGF是參與血管化調(diào)控的主要生長因子，可觸發(fā)一系列修復(fù)反應(yīng)，能有效促進血管內(nèi)皮細胞增殖及遷移，促進新血管形成，糖尿病難愈創(chuàng)面VEGF不僅呈低水平表達，表達高峰持續(xù)時間也縮短，是創(chuàng)面難愈的重要原因之一[16]。郭志良等[17]研究表明，白藜蘆醇等能激活受高糖損傷的大鼠內(nèi)皮祖細胞，改善其生物學功能以發(fā)揮促進血管新生的作用。本研究中治療組大鼠VEGF表達明顯高于模型組，新生血管增多，可能與象皮生肌膏改善了內(nèi)皮祖細胞和內(nèi)皮細胞的生物學功能有關(guān)。治療組大鼠第7、14、21天創(chuàng)面閉合率均明顯高于模型組，可見象皮生肌膏通過促進糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面血管的生成而加速了創(chuàng)面愈合。我們認為，象皮生肌膏可通過促進血管形成，改善局部血運，促使細胞增殖，加速肉芽組織生成和上皮化，從而促進糖尿病皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合。本實驗為初期實驗研究，主要進行了組織學觀察，具體作用機制尚需進一步研究。