魏宇唯，謝高宇，唐中生，林 吉，朱正耀，朱世杰，范瑞娟

（貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是指由于各種腦血管疾病所引起的顱腦功能障礙而出現(xiàn)以記憶、認知等方面的功能減退或消失為主要特征的一種獲得性智能損害綜合征，是一種慢性進行性疾病[1]。VaD的主要病因之一為腦血管疾病，包括出血性、缺血性腦卒中及其他腦血管疾病[2]，在老年性癡呆患者中此病約占20%，而發(fā)展呈慢性階梯式進展，隨著年齡增高而呈明顯增加趨勢，僅次于阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）[3]。據(jù)國內(nèi)外相關資料報道，VaD是可防治的一種癡呆性疾病，在疾病早期如果給予治療，病情具有可逆性[4]。

因此，防治VaD已成為亟須研究和解決的問題。突觸后致密物-95（postsynaptic density 95，Psd-95）和突觸囊泡膜蛋白（synaptophysin，Syp）是兩種突觸相關蛋白，研究表明，Psd-95和Syp在突觸連接中起到了貫通的“橋梁”作用，檢測其蛋白含量可一定程度上反映突觸傳遞效能[5]。同時，臨床上治療VaD的療效確切，其機制可能與突觸重塑密切相關，但目前針對電針“智三針”促進突觸重塑方面的研究較為缺乏。因此，本實驗以電針“智三針”為研究手段治療VaD大鼠，基于突觸可塑性，探討電針“智三針”改善VaD的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF級SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量300～350 g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：SCXK（湘）2014-0011，經(jīng)醫(yī)學實驗動物管理委員會批準，飼養(yǎng)于貴州中醫(yī)藥大學動物房。所有大鼠進行分籠飼養(yǎng)，適應性喂養(yǎng)7 d，整個實驗過程遵守實驗動物倫理學規(guī)定，并且符合SPF級實驗動物標準。

1.2 藥物與試劑 尼莫地平片（亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號：190309）；Psd-95兔多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-0179R）；Syp兔多克隆抗體（北京博奧森生物科技有限公司，貨號：bs-8845R）；山羊抗兔工作液（北京中杉金橋生物有限公司，貨號：SP-9001）；正常山羊血清（北京中杉金橋生物有限公司，貨號：ZLI-9021）；濃縮型DAB試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司，貨號：K135925C）；預染蛋白Marker（THERMO，貨號：26619，批號：00459134）；蛋白酶抑制劑（康為世紀，貨號：CW2200S，批號：60345）。

1.3 主要儀器SDZ-Ⅱ型華佗牌電針儀（濟南市天橋區(qū)銘泰醫(yī)療器械商行）；自制大鼠針灸固定器（貴州凱信生物科技有限公司）；XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統(tǒng)（上海欣軟信息科技公司）；EPS-300穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（Tanon）；Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System蛋 白電泳槽（BIO-RAD）；Mini Trans-Blot蛋白轉印系統(tǒng)（BIO-RAD）；LIDE 200掃描儀（日本佳能）；DW-86L386立式超低溫保存箱（Haier）。

1.4 造模與分組80只大鼠在室溫（23±3）℃條件下，給予充足的水和飼料飼養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)后非正常死亡3只，取其中65只大鼠采用改良Pulsinelli’s 4四血管阻斷法（4-VO）制作VaD大鼠模型。選用質(zhì)量分數(shù)為1%的戊巴比妥鈉進行腹腔麻醉（40 mg/kg），將大鼠俯臥固定于操作臺上，于枕部第一頸椎水平處做1～2 cm的縱向切口，以第一頸椎上穿出的神經(jīng)為標志，暴露第一頸椎翼突孔，用電凝針燒灼雙側椎動脈4～5次后縫合切口。將大鼠仰臥固定于操作臺上，頸前正中部位做1.0～1.5 cm的縱切口，在氣管兩側分離出雙側頸總動脈約1 cm，穿線以備次日用，術后給大鼠腹腔注射青霉素防止感染。次日將完全清醒的大鼠用合適的手法固定，拆開頸部縫合線，提起頸總動脈下的備用線，用微創(chuàng)動脈夾夾閉兩側頸總動脈，夾閉15 min后放開動脈夾，恢復血液供應，縫合切口，將大鼠放在干凈的籠中飼養(yǎng)。模型制作成功的標準：在夾閉雙側頸總動脈后意識喪失，昏迷，翻正反射消失，兩眼球變蒼白，瞳孔散大且對光反射消失。實驗過程中凡不符合上述標準或大鼠出現(xiàn)抽搐及死亡視為失敗，排除偏癱和癲癇的大鼠。

最終將造模成功且成活的48只VaD模型大鼠按隨機數(shù)字表法分為VaD模型組、尼莫地平組和電針智三針組，每組16只。12只未造模大鼠設為假手術組，假手術組僅暴露翼狀孔外口，分離頸總動脈，但不燒灼椎動脈，不夾閉頸總動脈。

1.5 實驗給藥 術后第8天開始治療，電針智三針組大鼠依據(jù)華興邦《實驗動物穴位圖譜》，選取百會穴作為參照，于大鼠百會穴正中前下方0.2 mm處取神庭穴，神庭穴兩側旁開0.5 mm處取本神穴，采用大鼠針灸固定器束縛，1寸毫針于皮下平刺，進針0.5寸，連接電針儀，施予20 Hz連續(xù)波，持續(xù)20 min。尼莫地平組大鼠灌胃給予尼莫地平溶液，20mg/（kg·d），并按電針智三針組相同束縛方法束縛20 min。假手術組與VaD模型組大鼠均灌胃給予蒸餾水，1 mL/100 g，并按電針智三針組相同束縛方法束縛20 min。均于每天9:00:00—12:00:00進行，1次/d，連續(xù)20 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 Morris水迷宮行為學檢測 治療結束后采用Morris水迷宮進行大鼠行為學檢測，以第1～6天的定位航行實驗和第7天的空間探索實驗作為測試的內(nèi)容。加入1 000 g奶粉至注水的水池中，使水的顏色變?yōu)椴煌该魅榘咨?，同時保持實驗過程中室內(nèi)光線強度一致，并使池內(nèi)水溫維持在（25±2）℃。實驗第1～6天進行定位航行實驗，將平臺放置在第三象限標志處，從另外3個象限依次將大鼠面壁放入水中，大鼠成功登上平臺5 s后即終止記錄時間，記錄時間最長為90 s。第7天撤除平臺進行空間探索實驗，依次將大鼠按象限放入水中。選取第1～6天定位航行實驗第一、二、四象限入水的逃避潛伏期時間變化及第7天空間探索實驗目標象限游泳時間及穿越平臺次數(shù)作為大鼠學習記憶能力的指標的反映。

1.6.2免疫組織化學法檢測Psd-95和Syp的表達 水迷宮檢測完畢后立即取材，各組按隨機數(shù)字表法選取6只大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，開胸后將灌注針從左心室直入升主動脈并固定，首先快速灌注沖洗使用生理鹽水400 mL，隨后進行灌注固定改用300 mL 4%多聚甲醛緩緩推入，灌注完畢剝離大腦置于固定液中固定，最后將腦組織包埋，切片后使用免疫組化法進行檢測，檢測VaD大鼠海馬區(qū)Psd-95和Syp的表達情況，高倍鏡下觀察海馬區(qū)不重疊的6個視野，圖像分析系統(tǒng)采用Image-Pro Plus6.0，測定得出采集的所有圖像的光密度和面積，計算出每個視野的平均光密度。

1.6.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測Psd-95和Syp的表達 各組剩余大鼠行深度麻醉后斷頭，置于冰上開顱取腦，同時立即剝離出新鮮海馬，將海馬CA1區(qū)組織置于2 mL EP管內(nèi)，于液氮中存放，全部取材完畢后放于-80℃冰箱保存。實驗時選用β-actin作為內(nèi)參蛋白，蛋白上樣量均為40 μg，抗體濃度為β-actin 1∶5 000；Psd-95 1∶600；Syp 1∶3 000。圖像分析選用ImageJ軟件測定各條帶的灰度值做定量分析，結果以目的蛋白/內(nèi)參的積分光密度值的比值表示。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件分析得出的所有實驗數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，使用GRAPHPAD PRISM軟件制作柱狀圖。兩組比較，滿足正態(tài)分布條件下，采用配對t檢驗，多組比較，采用單因素方差分析；不滿足正態(tài)分布條件下，采用非參數(shù)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Morris水迷宮行為學檢測結果 由于腦對缺血較為敏感，腦組織缺血會導致局部腦組織及其功能的損害，組織學變化出現(xiàn)腦水腫及腦細胞壞死，而長時間的嚴重缺血會引起梗死，造模后部分大鼠腦功能嚴重受損，產(chǎn)生缺血缺氧乃至死亡，因此采集標本時各組剩余大鼠數(shù)量分別為12、13、12、13只。

與假手術組比較，VaD模型組大鼠在2 d后逃避潛伏期明顯延長，而第三象限游泳時間和跨越平臺次數(shù)明顯減少（P＜0.05），提示造模成功，大鼠出現(xiàn)明顯的學習記憶障礙；與VaD模型組比較，電針智三針組在3、4、6 d逃避潛伏期明顯降低、在7 d第三象限游泳時間和跨越平臺次數(shù)明顯增加（P＜0.05），說明電針“智三針”能夠在一定程度上改善癡呆大鼠的學習記憶障礙。（見表1～2）

表1 各組大鼠定位航行試驗平均逃避潛伏期比較（±s，s）

表1 各組大鼠定位航行試驗平均逃避潛伏期比較（±s，s）

注：F時間主效應=67.004，P時間主效應=0.000；F分組主效應=20.282，P分組主效應=0.000；F交互效應=7.383，P交互效應=0.000；與假手術組比較，aP＜0.05；與VaD模型組比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 1 d 2 d 3 d 4 d 5 d 6 d F P假手術組 12 84.52±12.39 56.78±14.5 42.08±15.65 39.63±14.78 25.21±10.55 20.15±21.57 29.479 0.000 VaD模型組 13 82.53±13.19 83.49±6.99a 75.62±18.26a 64.54±23.20a 61.06±24.45a 57.07±23.06a 7.160 0.000尼莫地平組 12 84.59±10.37 72.57±14.81b 50.78±15.36b 49.68±15.94b 39.95±13.85b 27.34±11.17b 22.914 0.000電針智三針組13 86.61±8.76 67.73±16.57 59.40±18.18b 37.95±13.31b 49.53±22.14 37.26±21.17b 20.380 0.000 F 0.281 8.188 8.922 6.394 8.050 8.159 P 0.839 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000

不同組別大鼠逃避潛伏期與時間存在交互效應，隨時間的增加，各組逃避潛伏期時間逐漸下降。以假手術組下降幅度最大，電針智三針組在1～4 d呈下降趨勢，5 d有小幅上升，6 d下降達到最低，VaD模型組下降幅度最小。（見圖1）

圖1 大鼠逃避潛伏期時間的交互效應輪廓圖

表2 各組大鼠空間探索實驗第三象限活動時間和穿越站臺次數(shù)比較（±s）

表2 各組大鼠空間探索實驗第三象限活動時間和穿越站臺次數(shù)比較（±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與VaD模型組比較，bP<0.05

組別 動物數(shù)（只） 第三象限游泳時間（s）穿越平臺次數(shù)（次）假手術組 12 54.07±13.11 7.50±2.64 VaD模型組 13 25.66±10.44a 2.38±1.60a尼莫地平組 12 46.42±11.16b 5.75±2.05b電針智三針組 13 42.46±15.46b 4.92±1.61b

2.2 各組大鼠海馬CA1區(qū)PSD-95、Syp平均光密度值比較Psd-95、Syp的免疫產(chǎn)物呈黃色或棕黃色顆粒狀，與假手術組比較，VaD模型組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95、Syp的免疫產(chǎn)物明顯減少，平均光密度值明顯下降（P<0.05）；與VaD模型組比較，尼莫地平組與電針智三針組大鼠海馬CA1區(qū)的Psd-95、Syp的免疫產(chǎn)物明顯增多，平均光密度值均明顯升高（P<0.05）。（見表3、圖2）

圖2 各組大鼠海馬區(qū)Psd-95、Syp免疫組織化學染色圖（×400，標尺=40 μm)

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95、Syp平均光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95、Syp平均光密度值比較（±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與VaD模型組比較，bP<0.05

組別 動物數(shù)（只） Psd-95 Syp假手術組 6 0.22±0.02 0.20±0.02 VaD模型組 6 0.18±0.01a 0.17±0.01a尼莫地平組 6 0.20±0.02b 0.19±0.01b電針智三針組 6 0.19±0.01b 0.19±0.01b

2.3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Psd95、Syp蛋白表達比較 與假手術組比較，VaD模型組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95與Syp的條帶較窄，顏色較淺，蛋白表達量明顯減少（P<0.05）；與VaD模型組比較，電針智三針組與尼莫地平組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95與Syp的條帶較寬，顏色較深，蛋白表達量明顯增加（P<0.05）。（見圖3）

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)Psd-95、Syp蛋白表達比較（±s）

3 討 論

針灸學家靳瑞所創(chuàng)“智三針”由神庭、本神（雙）三穴組成，所取均是與神相關的穴位并位于前額上，“腦為元神之府”，神庭穴是腦內(nèi)元神所藏之處，而本神為諸神之本是足少陽膽經(jīng)脈氣所發(fā)。同時，大腦額葉是情感智力所在區(qū)域，三穴均位于大腦額葉表面的頭皮層。在現(xiàn)代針灸臨床中“智三針”被廣泛應用，治療與“腦”相關的精神神志類疾病有明顯效果[6]，而電針可以根據(jù)頻率、電壓和持續(xù)時間來進行標準化[7]。課題組既往的研究表明，電針“智三針”可使VaD模型大鼠相關的腦組織產(chǎn)生積極變化[8]，但其治療VaD的神經(jīng)生物學機制不明。

尼莫地平作為鈣拮抗劑，可用于缺血性腦血管病治療[9]。其作用于血管平滑肌，抑制腦缺血細胞去極化時K+外流，解除Ca2+內(nèi)流引起的平滑肌細胞收縮和血管痙攣，改善腦缺血缺氧，并增加腦血流量，同時抑制動脈平滑肌細胞內(nèi)磷酸二酯酶的活性，使細胞內(nèi)cAMP濃度增高，達到松弛動脈平滑肌，擴張全身小動脈，改善腦循環(huán)，發(fā)揮腦保護的作用[10]。

在神經(jīng)系統(tǒng)功能中，突觸與突觸傳遞的關系十分密切，同時突觸結構的可塑性也是學習記憶的神經(jīng)生物學基礎[11]。突觸連接可以完成神經(jīng)元對信號的接收與處理功能，而神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性在很大程度上由突觸在形態(tài)結構數(shù)量及功能狀態(tài)調(diào)節(jié)方面決定[12]。

Psd-95屬于Psd核心構架蛋白，位于突觸后膜上，是神經(jīng)細胞骨架蛋白的一種，既參與細胞內(nèi)信號轉導，又能調(diào)節(jié)離子通道與突觸活性[13]。Psd-95可以通過其自身不同的結構域與NMDR受體、鉀離子通道、細胞黏附因子、細胞質(zhì)蛋白相互結合，形成突觸相關的信號復合物，并將其傳輸至突觸后細胞[14-15]，因而在調(diào)控神經(jīng)元突觸可塑性與維持突觸后膜結構的穩(wěn)定中起著十分重要的作用。Syp是一種特殊的廣泛存在于神經(jīng)元突觸前膜中的蛋白，是突觸可塑性的特異性標志性分子物[16]。研究顯示，Syp與突觸重建和神經(jīng)元再生相關[17]，其調(diào)節(jié)突觸可塑性的方式通過影響突觸結構和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放來實現(xiàn)，并參與Ca2+依賴神經(jīng)遞質(zhì)釋放和囊泡運輸，而蛋白的表達量間接地反映了突觸結構的完整性和功能狀態(tài)[18]。劉斌等[19]發(fā)現(xiàn)腦缺血損傷后的大鼠海馬區(qū)突觸密度降低，突觸連接減少，Syp表達量下降。因此，Syp可以間接反映突觸形成和重塑的程度[20]。兩種突觸相關蛋白在突觸連接中起到了“橋”的作用，因此，Psd-95和Syp兩種蛋白含量的檢測可大致預估突觸發(fā)生、突觸數(shù)量，反映突觸的傳遞功能，是體現(xiàn)突觸可塑性的重要標志。

本研究在針灸學基本理論的指導下，采取電針“智三針”進行治療，觀察不同組別大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期和穿越平臺期的時間及海馬CA1區(qū)Psd-95和Syp的陽性細胞量與蛋白表達量，實驗結果表明，經(jīng)過電針“智三針”的治療的大鼠逃避潛伏期時間縮短，跨越平臺次數(shù)增加，提示學習記憶能力具有顯著改善。海馬CA1區(qū)是反映大腦缺血缺氧最為敏感的部位之一，并且Psd-95和Syp是中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前后的特殊分子標志物，總體趨勢上看，電針智三針組海馬CA1區(qū)Psd-95和Syp的陽性細胞量與蛋白表達量有不同程度的升高，其機制之一可能與電針“智三針”促進海馬CA1區(qū)突觸相關蛋白Psd-95和Syp的表達，改善突觸可塑性高度相關。但目前缺乏其他科學研究對照，考慮與樣本量小有關，下一步將繼續(xù)研究突觸相關蛋白在腦缺血損傷后的不同時間點的表達及智三針調(diào)節(jié)腦缺血后突觸可塑性的具體機制，為臨床提供一定的實驗依據(jù)。