程 希，周淑萍，何 杰

（1.中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院，安徽 合肥 230001；2.安徽理工大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 合肥 232001；3.東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009）

肝癌是一種肝臟惡性腫瘤，是目前臨床最為常見(jiàn)的腫瘤之一，可分為原發(fā)性和繼發(fā)性?xún)纱箢?lèi)。研究發(fā)現(xiàn)，每年新發(fā)肝癌患者在腫瘤發(fā)病中高居第5位[1]。不幸的是，大多數(shù)肝癌患者均在晚期被確診，缺乏早期有效治療。目前臨床上抗肝癌藥物主要是以化療藥物為主，可能產(chǎn)生不良反應(yīng)和毒副作用，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。因此，尋找低細(xì)胞毒性且有效的抗肝癌藥物尤為重要。

雷公藤是衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，藥理學(xué)作用主要包括抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等[3-4]。既往研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤可以通過(guò)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)周期、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體、血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡等機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用[5-6]。其中雷公藤有效活性成分雷公藤甲素（triptolide，TP）在抗腫瘤中被廣泛研究。研究表明，TP能夠通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子活性，激活Caspases通路，活化分裂原活化蛋白激酶，以及干預(yù)腫瘤細(xì)胞周期，抑制腫瘤血管形成等途徑發(fā)揮抗腫瘤作用[7-8]。但目前有關(guān)TP抗肝癌的分子作用機(jī)制尚不完全清晰。細(xì)胞焦亡是一種新的細(xì)胞死亡方式，廣泛參與了心血管疾病的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的進(jìn)程。因此，本研究擬通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究TP對(duì)肝癌細(xì)胞焦亡的影響及其分子作用機(jī)制，進(jìn)而為肝癌的防治提供新的方向。

1 材 料

1.1 細(xì)胞 人肝癌細(xì)胞株Bel-7402（中科院上海細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)：BEL7402-mCherry-luc）。

1.2 試劑 雷公藤甲素（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：T3652-1MG）；RPMI1640培養(yǎng)基（gibco公司，批號(hào)：14040-133）；胎牛血清（gibco公司，批號(hào)：12657-029）；CCK-8試劑盒（江蘇碧云天公司，批號(hào)：C0037）；PI染色試劑盒（江蘇碧云天公司，批號(hào)：ST511）；Caspase-3一抗（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：9662）；IL-1β一抗（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：3498）；IL-18一抗（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：3504）；GSDME一抗（Cell Signaling Technology公司，批號(hào)：5321）；β-actin一抗（江蘇碧云天公司，批號(hào)：AF5009）；一抗稀釋液和二抗稀釋液（江蘇碧云天公司，批號(hào)：P0256-100ml）；HRP標(biāo)記的兔二抗和鼠二抗（武漢博士德公司，批號(hào)：A0409）；IL-1β（江蘇碧云天公司，批號(hào)：PI305）；IL-18試劑盒（江蘇碧云天公司，批號(hào)：PI553）；GSDME siRNA和轉(zhuǎn)染試劑盒（廣州銳博公司，批號(hào)：C10511-05）。

1.3 主要儀器LWD300-38LFT型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；DW-40W255型低溫冰箱（中國(guó)海爾公司）；YXJ-2型高速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；H22822脫色搖床（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司）；XN55DZG303A型純水儀（美國(guó)Millipore公司）；JD801D型凝膠電泳成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 采用10%的胎牛血清完全培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株Bel-7402，培養(yǎng)基內(nèi)加入適量的HEPES抗生素，并將培養(yǎng)細(xì)胞放置于37℃含5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。上述細(xì)胞按照每2 d換液1次，3～4 d傳代處理。傳代比例1∶3。

2.2 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 將Bel-7402細(xì)胞按照密度為1×104/孔種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)12 h，傾去原培養(yǎng)基，加入終濃度為2.5、5、10 μg/mL的雷公藤甲素，同時(shí)設(shè)置加入等量培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，每組均設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，分別培養(yǎng)24 h；在避光條件下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混合均勻，并于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h；采用單功能酶標(biāo)儀設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm測(cè)定各孔吸光度值；依據(jù)各孔吸光度值進(jìn)行OD值處理，細(xì)胞活力（OD）=實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值-空白對(duì)照組細(xì)胞OD值。

2.3 GSDME siRNA轉(zhuǎn)染 在培養(yǎng)的細(xì)胞Bel-7402密度約占培養(yǎng)板的50%時(shí)，無(wú)血清同步化處理24 h后，按照轉(zhuǎn)染試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行GSDME siRNA轉(zhuǎn)染，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)板放置于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.4 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測(cè)細(xì)胞焦亡 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按照1×105/孔細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到50%～60%時(shí)，加入實(shí)驗(yàn)藥物雷公藤甲素與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，之后進(jìn)行PI和細(xì)胞核DAPI染色并于光學(xué)顯微鏡下拍照。

2.5 ELISA檢測(cè)IL-1β和IL-18的含量 收集各組細(xì)胞上清液，按照IL-1β和IL-18試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各自濃度測(cè)定。

2.6 Western blotting檢測(cè)腫瘤細(xì)胞GSDME、Caspase-3、IL-1β和IL-18表達(dá) 將處理完畢的腫瘤細(xì)胞清洗后放置于研磨管內(nèi)，按照合適的比例加入細(xì)胞裂解液放置于冰上裂解40min，每間隔5 min進(jìn)行細(xì)胞渦旋振蕩保證裂解完全，將裂解后的離心管放置于離心機(jī)內(nèi)，4℃，12 000 r/min離心10 min，得到細(xì)胞上清液。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，按照35 μg/孔上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，孵育GSDME一抗（1∶1 000），Caspase-3一抗（1∶1 000）、IL-1β一抗（1∶1 000）和IL-18一抗（1∶1 000）于4℃過(guò)夜，洗膜，孵育對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育60 min，TBST洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照，最后采用Image J軟件分析相關(guān)蛋白灰度值。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用ANOVA，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 TP對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響 與空白對(duì)照組比較，伴隨TP處理濃度的增加，肝癌細(xì)胞株Bel-7402的細(xì)胞活力均明顯降低（P＜0.01）。其中在TP處理濃度為10.0 μg/mL時(shí)腫瘤細(xì)胞活力降低最為顯著。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組Bel-7402細(xì)胞活力比較（±s，n=6）

3.2 TP對(duì)腫瘤細(xì)胞焦亡的影響PI染色結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，10.0 μg/mL的TP處理細(xì)胞能夠明顯增加PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目（P＜0.01），誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡；Western blotting結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，TP組能夠明顯促進(jìn)Caspase-3、GSDME-N、IL-1β和IL-18表達(dá)（P＜0.01）。（見(jiàn)圖2～3）

圖2 兩組細(xì)胞焦亡水平及比較（±s，n=6）

圖3 兩組細(xì)胞Caspase-3、GSDME、GSDME-N、IL-1β和IL-18蛋白表達(dá)及比較（±s，n=6）

3.3 TP對(duì)腫瘤細(xì)胞IL-1β和IL-18的影響 與空白對(duì)照組比較，TP組腫瘤細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18含量均明顯升高（P<0.01）。（見(jiàn)圖4）

圖4 兩組細(xì)胞IL-1β和IL-18的含量比較（±s，n=6）

3.4 siGSDME對(duì)肝癌細(xì)胞焦亡的影響 與TP組比較，轉(zhuǎn)染GSDME siRNA組PI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯降低（P<0.01），轉(zhuǎn)染GSDME無(wú)關(guān)片段組對(duì)焦亡影響不明顯。（見(jiàn)圖5）

圖5 各組細(xì)胞焦亡的情況及比較（±s，n=6）

4 討 論

肝癌作為我國(guó)最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅了患者的生命。早期診斷和早期治療是改善肝癌患者生存預(yù)后的有效方式[9]。近年來(lái)，有關(guān)肝癌的治療取得了一定程度的發(fā)展，其中臨床治療上主要是以手術(shù)、介入、放療及抗腫瘤藥物治療等方式進(jìn)行干預(yù)[10]。越來(lái)越多的研究者把目光投向了中醫(yī)藥療法。

雷公藤是一種有效的抗腫瘤中藥，研究發(fā)現(xiàn)TP作為雷公藤有效活性成分能夠通過(guò)抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡及抑制血管生成等方式抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[11-12]。研究表明，TP具有明顯的抗腫瘤活性。在非小細(xì)胞肺癌中，TP能夠抑制MAPK信號(hào)通路，抑制血管生成，改善非小細(xì)胞肺癌患者臨床癥狀[13]。在乳腺癌細(xì)胞系中，給予TP能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Bax表達(dá)[14]。上述研究均表明雷公藤甲素在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。新近研究發(fā)現(xiàn)，活化Caspase-3不僅能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡也能夠誘導(dǎo)GSDME依賴(lài)性細(xì)胞焦亡[15]。當(dāng)細(xì)胞高表達(dá)GSDME時(shí)活化Caspase-3能夠誘導(dǎo)GSDME依賴(lài)性細(xì)胞焦亡，而當(dāng)細(xì)胞低表達(dá)GSDME時(shí)激活Caspase-3會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15-17]。但是有關(guān)Caspase-3介導(dǎo)的GSDME型細(xì)胞焦亡在肝癌中的作用尚不清楚。細(xì)胞焦亡是一種新的細(xì)胞死亡方式。既往研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞焦亡是由Caspases介導(dǎo)的細(xì)胞炎癥性死亡。細(xì)胞焦亡主要可分為Caspase-1/4/5/11介導(dǎo)的GSDMD依賴(lài)性細(xì)胞焦亡和Caspase-3介導(dǎo)的GSDME依賴(lài)性細(xì)胞焦亡兩大類(lèi)[15,18]。GSDME作為Gasdermins家族蛋白成員之一，由具有細(xì)胞毒性的GSDME-N和GSDME-C組成。當(dāng)細(xì)胞受到外界致病因子或是死亡信號(hào)刺激后會(huì)通過(guò)活化Caspase-3，進(jìn)而促使GSDME剪切形成GSDME-N片段，隨后其與細(xì)胞膜上的磷脂分子結(jié)合形成GSDME細(xì)胞孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容如IL-1β、IL-18等無(wú)釋放直至細(xì)胞腫脹破裂[19]。近年來(lái)，有關(guān)Caspase-3介導(dǎo)的GSDME依賴(lài)性細(xì)胞焦亡在腫瘤進(jìn)展中廣泛研究[15]。因此，通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡可能成為抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要手段。為此，我們通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探究TP對(duì)細(xì)胞Bel-7402焦亡的影響及其分子作用機(jī)制。通過(guò)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株Bel-7402。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，隨著TP濃度的增加細(xì)胞活力明顯降低。采用10.0 μg/mL TP處理Bel-7402，細(xì)胞焦亡數(shù)量明顯增加。以上結(jié)果表明，TP能夠有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞焦亡發(fā)生過(guò)程。為進(jìn)一步闡明TP對(duì)細(xì)胞焦亡的分子作用機(jī)制，實(shí)驗(yàn)通過(guò)Western blotting檢測(cè)焦亡相關(guān)蛋白Caspase-3、GSDME、IL-1β以及IL-18表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，TP組細(xì)胞Caspase-3、GSDME-N、IL-1β及IL-18表達(dá)明顯升高，同時(shí)細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18釋放明顯增加。上述研究結(jié)果表明，TP能夠通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞焦亡過(guò)程，抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)轉(zhuǎn)染GSDME siRNA 24 h后TP處理細(xì)胞Bel-7402，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與TP組細(xì)胞比較，GSDME siRNA能夠顯著抑制細(xì)胞焦亡。

綜上所述，TP能夠通過(guò)促進(jìn)Caspase-3介導(dǎo)的GSDME依賴(lài)性細(xì)胞焦亡過(guò)程，抑制肝癌細(xì)胞增殖，改善肝癌進(jìn)程。上述研究結(jié)果為T(mén)P用于治療肝癌提供了新的理論基礎(chǔ)。