鄭金玲，石 巖，楊宇峰，姜永梅，孫紅曉

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽(yáng) 110847；2.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧 大連 116023；3.山東沂水縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 276400）

糖尿病是指以高血糖為特征的一類代謝性疾病，由胰島素分泌不足或其作用障礙導(dǎo)致血糖升高引發(fā)[1]。缺血性腦卒中是指由于腦供血?jiǎng)用}（頸動(dòng)脈和椎動(dòng)脈）狹窄或閉塞，引起腦供血不足導(dǎo)致的腦組織壞死的總稱。糖尿病患者機(jī)體長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈血管壁的損傷及血管內(nèi)皮的脂質(zhì)沉積，血管內(nèi)皮雜質(zhì)的沉積使管腔狹窄甚至閉塞，從而引起缺血性腦卒中[2-3]。腦卒中一旦發(fā)生，患者有很大發(fā)生二次栓塞的可能，有關(guān)缺血性腦卒中的流行病學(xué)調(diào)查表明，在1型糖尿病、2型糖尿病患者中，缺血性腦卒中的復(fù)發(fā)率分別為40.9%和29.7%[4]。一旦患病，會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量及生活水平，給患者帶來(lái)極大的生理、心理負(fù)擔(dān)。據(jù)調(diào)查，中國(guó)腦卒中死亡年齡呈明顯下降趨勢(shì)，且高血糖為其中危險(xiǎn)因素之一[5]。目前已經(jīng)有研究證實(shí)，糖尿病患者的血糖水平與缺血性卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)，即血糖水平越高，缺血性卒中發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)越高[2]。目前西醫(yī)對(duì)于腦卒中的治療方法主要以阿司匹林等抗血小板聚集藥為主，以及降糖、降脂、神經(jīng)保護(hù)、纖溶酶治療等方案[6-7]。雖然可以減少腦血管病的發(fā)生，但糖尿病患者合并缺血性腦卒中的發(fā)病率依然存在[8]。糖尿病合并缺血性腦卒中在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”“中風(fēng)”等范疇[9]。近年來(lái)，應(yīng)用中醫(yī)藥治療該病的患者越來(lái)越多并且在臨床中取得了很好的療效，但并沒(méi)有應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘方法分析其用藥規(guī)律以及作用機(jī)制的研究[10]。本研究通過(guò)檢索中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的臨床研究，應(yīng)用數(shù)據(jù)挖掘、分子對(duì)接方法探究中醫(yī)藥發(fā)揮藥效的可能機(jī)制，為臨床治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)選取 通過(guò)對(duì)中國(guó)知網(wǎng)、CBM、萬(wàn)方、維普等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，以“糖尿病合并缺血性腦卒中”“糖尿病”“缺血性腦卒中”“醫(yī)案”“經(jīng)驗(yàn)總結(jié)”“中藥”“方劑”等作為主題詞，檢索起止時(shí)間為建庫(kù)至2020年6月。選取應(yīng)用中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的醫(yī)案、病例分析、隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)等，并由兩名人員獨(dú)立提取文獻(xiàn)中所涉及的方劑。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)（1）符合糖尿病合并缺血性腦卒中的中西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）療效標(biāo)準(zhǔn)參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[11]。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)（1）綜述、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)類文章；（2）干預(yù)措施不是中藥口服湯劑；（3）四診資料不全、用藥配方不詳、療效不確定；（4）重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)。

1.4 數(shù)據(jù)挖掘方法

1.4.1 分析軟件錄入與核對(duì) 本研究經(jīng)規(guī)范處理后由雙人錄入古今醫(yī)案云平臺(tái)V2.2.1軟件，建立“中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數(shù)據(jù)庫(kù)”進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘。在古今醫(yī)案云平臺(tái)首頁(yè)，選擇“醫(yī)案數(shù)據(jù)采集”，點(diǎn)擊“批量導(dǎo)入”。古今醫(yī)案云平臺(tái)配備專業(yè)中醫(yī)藥術(shù)語(yǔ)庫(kù)，幫助用戶進(jìn)行數(shù)據(jù)智能規(guī)范化。同時(shí)支持用戶手動(dòng)修正標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)容，并存儲(chǔ)為標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)案庫(kù)。利用“醫(yī)案統(tǒng)計(jì)分析”中“醫(yī)案標(biāo)準(zhǔn)化”功能，將本研究導(dǎo)入的“中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數(shù)據(jù)庫(kù)”中的疾病、證候、中藥等數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.4.2 數(shù)據(jù)分析 本研究將標(biāo)準(zhǔn)化后的“中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的數(shù)據(jù)庫(kù)”點(diǎn)擊“批量加入分析池”按鈕，全部加入分析池進(jìn)行醫(yī)案分析。利用古今醫(yī)案云平臺(tái)數(shù)據(jù)挖掘分析模塊可對(duì)加入分析池的醫(yī)案數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和挖掘，包括中藥統(tǒng)計(jì)、中藥配伍、四診與中藥、病證與中藥、中藥屬性（四氣、五味、歸經(jīng)、功效）、中藥聚類分析等內(nèi)容[12-13]。

1.4.3 復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析 使用Gephi-0.9.2軟件實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，通過(guò)不同的布局算法或者通過(guò)不同的統(tǒng)計(jì)方法對(duì)網(wǎng)絡(luò)的總體特征、節(jié)點(diǎn)特征及節(jié)點(diǎn)與邊的相關(guān)性等分析，供研究者發(fā)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中的規(guī)律。故本研究利用該軟件，通過(guò)對(duì)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)，以發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中的核心方藥。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）網(wǎng)站[14]（http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲得糖尿病合并缺血性腦卒中核心藥物所含的化學(xué)成分，將口服吸收率（OB≥30%）、類藥性（DL≥0.18）作為篩選條件并獲取相應(yīng)靶點(diǎn)。通過(guò)TTD、DisGeNET、G eneCards等數(shù)據(jù)庫(kù)以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”為主題詞獲取疾病靶點(diǎn)。將疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)取交集后，導(dǎo)入Cytoscape（3.6.0）軟件構(gòu)建“藥物成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。利用RProject進(jìn)行GO注釋和KEGG通路富集分析[15]，進(jìn)一步了解上述核心靶點(diǎn)的生物功能及在信號(hào)通路中的作用。

1.6 分子對(duì)接 通過(guò)RSCB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.rcsb.org/）下載PDB格式文件，準(zhǔn)備好核心靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)文件。通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)下載核心化合物SDF格式的2D結(jié)構(gòu)文件，應(yīng)用Chem 3D軟件轉(zhuǎn)化為PDB格式。運(yùn)用PyMOL軟件對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行去水、加氫等操作，利用AutoDock軟件將化合物及靶蛋白格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運(yùn)行Vina進(jìn)行對(duì)接。選取結(jié)合能較低且構(gòu)象較好采用Discovery Studio、Pymol及Ligplus軟件進(jìn)一步分析展示對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 中藥頻數(shù)統(tǒng)計(jì) 根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)篩選后，共納入74篇文獻(xiàn)進(jìn)行本次研究，包含中藥方劑94首，涉及中藥32味。對(duì)94首中藥湯劑數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物頻數(shù)統(tǒng)計(jì)，頻數(shù)≥25的中藥共14味，頻數(shù)排序前5位的分別為黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、丹參。（見表1）

表1 中藥使用頻數(shù)表（頻數(shù)≥25）

2.2 中藥配伍關(guān)聯(lián)分析 本研究使用關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，挖掘藥物之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，其中支持度表示同時(shí)包含A和B的事物占所有事物的比例。如果用P（A）表示使用A事物的比例，那么支持度=P（A∪B）?？尚哦缺硎臼褂冒珹的事物中同時(shí)包含B事物的比例，即同時(shí)包含A和B的事物占包含A事物的比例，可信度=P（A∪B）/P（A）。提升度表示“包含A的事物中同時(shí)包含B事物的比例”與“包含B事物的比例”的比值。提升度=P（B|A）/P（B），提升度反映了關(guān)聯(lián)規(guī)則中的A與B的相關(guān)性，提升度>1且越高表明正相關(guān)性越高，提升度<1且越低表明負(fù)相關(guān)性越高，提升度=1表明沒(méi)有相關(guān)性。

將納入方劑數(shù)據(jù)進(jìn)行藥物關(guān)聯(lián)分析，經(jīng)過(guò)篩選同現(xiàn)頻數(shù)≥20，置信度≥0.8，支持度≥0.2，最終得到關(guān)聯(lián)規(guī)則數(shù)據(jù)20條，其中排名前5的藥物配伍為川芎-黃芪、當(dāng)歸-黃芪、地龍-黃芪、丹參-黃芪、地龍-川芎。（見表2）

表2 中藥配伍關(guān)聯(lián)分析表

續(xù)表2：

本研究對(duì)上述頻數(shù)≥20共20個(gè)藥對(duì)，運(yùn)用Gephi進(jìn)行藥物歸類可視化分析。源節(jié)點(diǎn)（Source）為藥物A名稱，目標(biāo)節(jié)點(diǎn)（Target）為藥物B名稱，以此對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，如源節(jié)點(diǎn)為“當(dāng)歸”，則目標(biāo)節(jié)點(diǎn)設(shè)置為“川芎”。將預(yù)處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Gephi軟件，關(guān)系選為“邊表格”，字符集選為“GB2312”，選取模塊化處理，分別點(diǎn)擊“平均度”“模塊化”“特征向量中心度”及“網(wǎng)絡(luò)直徑”來(lái)計(jì)算網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣鲄?shù)，選擇Fruchteiman Reingold布局運(yùn)行，并根據(jù)節(jié)點(diǎn)度來(lái)植染圖中節(jié)點(diǎn)的大小，區(qū)值為10 000.0，重力值為10.0，速度為1.0進(jìn)行可視化展示。（見圖1）

圖1 核心用藥網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖

2.3 中藥聚類分析 對(duì)藥物頻數(shù)排名前30的中藥進(jìn)行Ward法聚類分析。以距離≥7為界，可以將上述藥物分為4組，第一組：黃芪、地龍、川芎；第二組：紅花、桃仁、當(dāng)歸、赤芍；第三組：生地黃、五味子、天花粉、麥冬、白芍、茯苓、黨參、炙甘草；第四組：水蛭、牛膝、石菖蒲、黃連、熟地黃、丹參、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白術(shù)、山藥、大黃、澤瀉、南沙參。（見圖2）

圖2 中藥聚類分析圖

2.4 中藥功效統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果 對(duì)94首治療糖尿病合并缺血性腦卒中的中藥功效進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到使用頻數(shù)較高的藥物功效從高到低的頻數(shù)排列結(jié)果，其中生津養(yǎng)血藥使用頻數(shù)最高86次。頻數(shù)排序前5位的分別為生津養(yǎng)血藥、清熱涼血藥、潤(rùn)腸通便藥、利水消腫藥、行滯通痹藥。排序前10的中藥功效頻數(shù)排序數(shù)據(jù)見表3。

表3 中藥功效頻數(shù)表

3 核心配伍分子機(jī)制探討

上述數(shù)據(jù)挖掘研究得出治療糖尿病合并缺血性腦卒中的高頻用藥主要為黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、丹參等，用藥配伍關(guān)聯(lián)規(guī)則分析、聚類結(jié)果提示“黃芪-川芎”的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度最高。所以“黃芪-川芎”為治療糖尿病合并缺血性腦卒中的核心配伍用藥，對(duì)其中的分子機(jī)制作進(jìn)一步探討。

3.1 “黃芪-川芎”的化合物成分收集 通過(guò)在TCMSP網(wǎng)站中檢索“黃芪”“川芎”。將口服吸收率（OB≥30%）和類藥性（DL≥0.18）作為篩選條件，得到黃芪化合物成分16個(gè)，靶點(diǎn)276個(gè)；川芎化合物成分7個(gè)，靶點(diǎn)75個(gè)。

3.2 疾病靶點(diǎn)收集 通過(guò)在TTD、DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)以“Diabetes Mellitus Combined with Cerebral Infarction”為主題詞，分別檢索得到23、1 189、3 082個(gè)疾病靶點(diǎn)，經(jīng)查重共檢索到3 353個(gè)糖尿病合并缺血性腦卒中的潛在作用靶點(diǎn)。

3.3 “黃芪-川芎”化合物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建“黃芪-川芎”化合物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，圖中共包含161個(gè)節(jié)點(diǎn)（2個(gè)中藥、18個(gè)化合物成分、141個(gè)靶點(diǎn)）、294條邊。其中橙色代表黃芪及其化合物、藍(lán)色代表川芎及其化合物、紅色為多靶點(diǎn)交叉的化合物、綠色代表疾病靶點(diǎn)。應(yīng)用Network Analyze獲取相關(guān)拓?fù)鋮?shù)，首先選取節(jié)點(diǎn)度值（degree）的中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，其次以介度（betweenness）和節(jié)點(diǎn)緊密度（closeness）的中位數(shù)作為篩選依據(jù)，共得到核心化合物成分17個(gè)、核心靶點(diǎn)53個(gè)。（見圖3、表4）

圖3 “黃芪-川芎”化合物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

表4 degree≥10 化合物成分與靶點(diǎn)表

續(xù)表4：

其中排名前5的化合物為槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）、黃芪總皂苷（isorhamnetin）、芒柄花素（formononetin）、楊梅酮（myricanone），可能是“黃芪-川芎”發(fā)揮藥效的成分之一。排名前5 的核心靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，分別與15、11、10、8、8個(gè)化合物發(fā)生相互作用，可能是“黃芪-川芎”治療糖尿病合并缺血性腦卒中發(fā)揮作用的靶點(diǎn)。3.4 基因GO與KEGG通路富集分析 利用R Project中的BiocManager、clusterProfiler等安裝包，將上述53個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO注釋、KEGG通路富集分析。GO富集分析結(jié)果：生物過(guò)程（BP）P<0.05的條目有1 064個(gè)，細(xì)胞組成（CC）P<0.05的條目有29個(gè)，分子功能（MF）P<0.05的條目有71個(gè)?？v坐標(biāo)為GO的名稱，橫坐標(biāo)為富集在每一個(gè)GO的數(shù)目，顏色越趨近于紅色代表P-Value越小，富集越高。（見圖4）

圖4 GD 富集分析barplot 圖

KEGG通路富集分析結(jié)果：縱坐標(biāo)為KEGG的名稱，橫坐標(biāo)為富集在每一個(gè)KEGG的比例，圓圈的大小為富集的數(shù)目，顏色越趨近于紅色代表P-Value越小，富集越高。主要涉及Endorine resistance、Platinum drug resistance、Metabolism of xenobiotics by cytochrome P450、Tryptophan metabolism、Drug metabolism-cytochrome P450、PPAR signaling pathway等信號(hào)通路。（見圖5）

圖5 KEGG 通路富集分析barplot 圖

3.5 “黃芪-川芎”部分化合物作用于核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接 本研究將degree排名前5的化合物成分及5個(gè)核心靶點(diǎn)PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA分別進(jìn)行分子對(duì)接。（見表5）使用Autodock Vina和Pymol腳本完成高通量分子對(duì)接，一般認(rèn)為配體與受體相互作用的親和力越強(qiáng)，所需能量越少，其發(fā)生作用的可能性越大。分子對(duì)接的結(jié)果顯示，這些化合物與核心靶點(diǎn)的結(jié)和能均低于-5.2 kcal/mol，表明親和力較強(qiáng)。為了進(jìn)一步研究配體與受體相互作用關(guān)系，采用Pymol對(duì)化合物小分子進(jìn)行加氫、加電荷、刪除水溶劑等處理，運(yùn)用Discovery Studio 3.5 Client、Pymol、Ligplus軟件對(duì)結(jié)合能排名前三的“化合物-蛋白”對(duì)接構(gòu)象進(jìn)行可視化展示，見圖6～8。圖中顏色越接近粉色親水作用越強(qiáng)，反之越接近綠色疏水作用越強(qiáng)，圖中應(yīng)用Pymol展示空間結(jié)構(gòu)、結(jié)合殘基名稱及其氫鍵，圖Ligplus使用2D效果具體體現(xiàn)不用殘基間的氫鍵距離，距離越短氫鍵的作用越強(qiáng)，結(jié)合的越緊密。

表5 degree 排名前5 的化合物與核心靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)結(jié)合能表

圖6 quercetin -PTGS2 分子對(duì)接圖

圖7 isorhamnetin-PTGS2 分子對(duì)接圖

圖8 kaempferol-PTGS2 分子對(duì)接圖

4 討 論

糖尿病合并缺血性腦卒中在中醫(yī)學(xué)中屬于“消渴”“中風(fēng)”等范疇[16]，消渴病的病機(jī)主要為陰虛燥熱，消渴病日久氣陰兩虛而致血脈運(yùn)行無(wú)力形成血脈瘀滯，成為了中風(fēng)發(fā)生的危險(xiǎn)因素[17]。中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中應(yīng)以活血化瘀、益氣養(yǎng)陰為主。目前，通過(guò)中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中已經(jīng)取得很好的療效[18]，但至今沒(méi)有關(guān)于其用藥規(guī)律的統(tǒng)計(jì)分析，本次研究得出黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、丹參、赤芍、生地黃、紅花、葛根、桃仁、麥冬、水蛭、甘草、山萸肉等為治療糖尿病合并缺血性腦卒中的高頻使用藥物，功效均以活血化瘀、益氣養(yǎng)陰為主。藥物關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)川芎-黃芪、當(dāng)歸-黃芪、地龍-黃芪、丹參-黃芪、地龍-川芎等藥物相互配伍頻率較高，說(shuō)明臨床上常用黃芪配伍活血藥治療，起到補(bǔ)氣活血的功用。本次研究在聚類分析中共得出4組藥物，第一組：黃芪、地龍、川芎；第二組：紅花、桃仁、當(dāng)歸、赤芍；第三組：生地黃、五味子、天花粉、麥冬、白芍、茯苓、黨參、炙甘草；第四組：水蛭、牛膝、石菖蒲、黃連、熟地黃、丹參、葛根、甘草、天麻、山萸肉、白術(shù)、山藥、大黃、澤瀉、南沙參；4組藥物主要功效均以行滯通痹、活血化瘀、益氣養(yǎng)陰生津?yàn)橹鳎c上述功效統(tǒng)計(jì)結(jié)果相一致。其中黃芪、川芎是本次研究中使用的高頻藥物，黃芪味甘、微溫，是補(bǔ)中益氣的要藥，同時(shí)還具有利水消腫、固表止汗、托毒斂瘡的功效，川芎味辛、性溫，能夠活血行氣、祛風(fēng)止痛，常用于治療瘀血阻滯的各種病癥?，F(xiàn)代研究表明，吳英萍等[19]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α的水平，來(lái)改善胰島素抵抗，降糖效果顯著優(yōu)于單用胰島素。賈新菊等[20]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過(guò)改善血管炎性病變，來(lái)降低糖尿病小鼠的血糖和糖化血紅蛋白水平。周佳等[21]發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可下調(diào)腦組織中NF-κB蛋白表達(dá),抑制氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，從而有效減輕大鼠因腦缺血再灌注導(dǎo)致的神經(jīng)功能缺損。方翔[22]發(fā)現(xiàn)川芎可通過(guò)影響神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞Ube3aas基因水平治療腦缺血小鼠。吳作敏等[23]亦認(rèn)為“黃芪-川芎”藥對(duì)可以通過(guò)調(diào)控多條通路治療腦卒中。劉曉瑞等[24]應(yīng)用益氣活血法治療糖尿病大鼠，可以改善大鼠脂代謝的紊亂，延緩糖尿病大血管病變的進(jìn)展。

在“黃芪-川芎”-糖尿病合并缺血性腦卒中靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中篩選出53個(gè)核心靶點(diǎn)，其中排名前5靶點(diǎn)為PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、NOS2、RXRA，說(shuō)明在此網(wǎng)絡(luò)中起到重要的作用。目前研究表明，PTGS1、PTGS2蛋白是前列腺素合成的主要限速酶，即前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶1和環(huán)氧化酶2，其環(huán)氧化酶2是花生四烯酸代謝的起始限速酶-環(huán)氧化酶的同工酶[25]，王熠等[26]發(fā)現(xiàn)環(huán)氧化酶2的表達(dá)及活性增加參與了血管內(nèi)皮胰島素抵抗對(duì)內(nèi)皮功能的影響。張如意等[27]認(rèn)為糖尿病大血管病變的發(fā)生和發(fā)展可能與環(huán)氧化酶2 的激活有關(guān)。HSP90AA1是熱休克家族蛋白的一種，在糖尿病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起到重要作用的分子伴侶蛋白家族[28]，王嬌等[29]發(fā)現(xiàn)HSP90AA1可以有效延緩糖尿病并發(fā)癥的進(jìn)展。NOS2是一種誘導(dǎo)性一氧化氮合酶，NOS2的遺傳多態(tài)性可能與糖尿病的易感性相關(guān)[30]。陸迪菲等[31]認(rèn)為NOS是血管內(nèi)皮功能重要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)多種機(jī)制參與心血管保護(hù)作用，能夠有效抑制糖尿病大血管病變的發(fā)生和發(fā)展。RXRA是一種視黃酸受體，陳春蓮等[32]發(fā)現(xiàn)視黃酸受體反應(yīng)蛋白水平的升高可能與糖尿病大血管病變的發(fā)展有關(guān)，患者血漿視黃酸受體反應(yīng)蛋白、CRP的水平與HbA1c、HOMA-IR的關(guān)系呈正相關(guān)。為中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供了有效依據(jù)。

GO富集通路分析顯示，“黃芪-川芎”-糖尿病合并缺血性腦卒中的主要環(huán)節(jié)是BP，如抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)活性氧代謝、炎癥反應(yīng)、對(duì)有毒物質(zhì)、類固醇激素、抗生素、異種生物刺激、脂多糖等的響應(yīng)，改善激素水平（包括類固醇激素、雌激素、性激素等）、調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)（藥物、異源刺激、類固醇激素刺激等）。CC主要涉及核染色質(zhì)、核染色體部分、神經(jīng)細(xì)胞體、受體復(fù)合體、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、突觸膜等部分。MF主要涉及酶結(jié)合（蛋白磷酸酶、磷酸酶、蛋白酶、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶抑制劑活性等），相關(guān)活性因子（類固醇激素受體活性、核受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、絲氨酸水解酶活性、抗氧化活性等），蛋白結(jié)合（熱激蛋白、肌動(dòng)蛋白、Hsp90蛋白等）等各方面。KEGG富集通路分析顯示，P-Value排序前20條的信號(hào)通路主要涉及PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Endocrine resistance3條內(nèi)分泌相關(guān)代謝通路，以及Ras signaling pathway、ErbB signaling pathway、FoxO signaling pathway、p53 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Chemokine signaling pathway、cAMP signaling pathway、Sphingolipid signaling pathway、Calcium signaling pathway、Rap1 signaling pathway等10條信號(hào)通路。目前研究發(fā)現(xiàn)，PI3K-AKT信號(hào)通路是胰島素轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要信號(hào)通路，是調(diào)控血糖的重要通道[33]。朱百科等[34]發(fā)現(xiàn)川芎可通過(guò)介導(dǎo)PI3K-AKT信號(hào)通路，對(duì)腦缺血再灌注具有明顯的保護(hù)作用。miR-145可通過(guò)靶向MAPK通路保護(hù)腦缺血性中風(fēng)大鼠神經(jīng)元干細(xì)胞[35]。李建設(shè)等[36]發(fā)現(xiàn)鼠李黃素可能通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路，修復(fù)糖尿病腦梗死大鼠腦組織損傷和炎癥反應(yīng)。陳麗莉[37]發(fā)現(xiàn)糖尿病大血管病變的發(fā)生有磷酸化p38MAPK的參與，干預(yù)p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能夠延緩糖尿病大血管病變的發(fā)生、發(fā)展。趙海云等[38]通過(guò)臨床研究發(fā)現(xiàn)自擬益氣滋陰消瘀方可使患者血脂、同型半胱氨酸、纖維蛋白原降低，使患者神經(jīng)功能提高，進(jìn)而治療T2DM合并腦梗死。

分子對(duì)接結(jié)果顯示，槲皮素、黃芪總皂苷、山柰酚與PTGS2主要與135、45、47位甘氨酸，34位天冬酰胺，39位組氨酸等氨基酸殘基發(fā)生氫鍵、疏水、范德華力等相互作用。

本次研究對(duì)中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中進(jìn)行用藥規(guī)律分析，結(jié)果表明，高頻應(yīng)用藥物為黃芪、川芎、當(dāng)歸、地龍、丹參、赤芍、生地黃等，以補(bǔ)氣養(yǎng)陰、活血化瘀、行滯通痹為主要治法。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果表明，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)將化合物與核心靶點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合能探測(cè)，進(jìn)一步探究了“黃芪-川芎”治療糖尿病合并缺血性腦卒中的可能作用機(jī)制，預(yù)測(cè)潛在作用靶點(diǎn)、通路及作用方式，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點(diǎn)、協(xié)同作用的特點(diǎn)，為今后臨床應(yīng)用中醫(yī)藥治療糖尿病合并缺血性腦卒中提供了研究方向及用藥依據(jù)。