庾杰華，郭秀彩，鄧英光，賀周揚，張紫萍

（1.廣州市第十二人民醫(yī)院，廣東 廣州 510620；2.廣東嘉博制藥有限公司，廣東 清遠 511500）

不能生育的育齡夫婦中，男性不育者大約占50%，而少、弱精子癥是導致男性不育的主要原因之一[1]。世界衛(wèi)生組織規(guī)定，精子數(shù)小于2×107/mL為少精子癥。近年來，男性不育癥呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，但仍缺乏有效的治療藥物。中藥具有多靶點、多途徑和辨證論治的優(yōu)點，近年來，中醫(yī)藥在治療精子質(zhì)量低下方面具有一定的優(yōu)勢[2]。淫羊藿屬于小檗科多年生直立草本植物，是一種傳統(tǒng)的補益類中藥，具有補腎陽、強筋骨和祛風濕的作用[3]。淫羊藿苷（Icariin，ICA）是淫羊藿的主要有效成分[4]，現(xiàn)代藥理研究證明，淫羊藿苷具有提高性功能[5]、促進性腺發(fā)育和促進雄激素分泌等作用[6]。本研究擬通過觀察淫羊藿苷對大鼠少精子癥的治療作用和可能的作用機制，探索淫羊藿苷對男性不育癥的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡雄性SPF級SD大鼠60只，體質(zhì)量200～230 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK（湘）2016-0002。動物自由攝食和飲水，飲用水為滅菌水，每天更換水瓶，飼養(yǎng)溫度22～25℃，濕度為40%～60%。經(jīng)本單位醫(yī)學實驗動物管理委員會批準，實驗后大鼠處死方法：10%水合氯醛溶液，以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射，大鼠麻醉后，腹主動脈放血處死大鼠。

1.2 藥物與試劑淫羊藿苷（上海友思生物技術有限公司，批號：160306，純度98%）；男寶膠囊（山西康威制藥有限責任公司，批號：1601074）；腺嘌呤（美國BIORULER公司，貨號：RH31666-25g）；羧甲基纖維素鈉（美國BIORULER公司，貨號：RH30500-500g）；SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160311）；MDA試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20160414）；睪酮ELISA試劑盒（武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司，批號：L160309171）；尿素氮試劑盒（日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：2016228）；肌酐試劑盒（日本和光純藥工業(yè)株式會社，批號：2016364）。

1.3 主要儀器MK3型酶標儀（芬蘭TECAN GENios公司）；離心機（美國Thermo Fisher公司）；LAbSPECT-003型全自動生化分析儀（日本日立公司）；BX43顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.4 分組將60只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周，按體質(zhì)量隨機分為正常組、模型組、淫羊藿苷低劑量組、淫羊藿苷中劑量組、淫羊藿苷高劑量組和男寶膠囊組，每組10只。

1.5 實驗給藥淫羊藿低、中、高劑量組大鼠分別灌胃給予5、10和20 mg/kg的淫羊藿苷溶液，男寶膠囊組大鼠灌胃給予350 mg/kg的男寶膠囊溶液，正常組及模型組大鼠灌胃等體積去離子水，給藥體積均為1 mL/100 g，1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.6 造模在給藥的同時造模，每天給藥4 h后，除正常組外，其他組大鼠給予250 mg/kg腺嘌呤混懸液進行造模，正常組灌胃等體積的0.5%CMC溶媒，每天給予造模藥物1次，連續(xù)給藥4周。實驗結束后，取大鼠附睪，采用血細胞計數(shù)板進行精子計數(shù)及形態(tài)學分析，計算精子密度、活動率和精子畸形率指標，造模組大鼠的精子密度和精子活動率明顯低于正常組即為造模成功。

1.7 觀察指標

1.7.1 一般狀態(tài)觀察 實驗過程中，各組大鼠每周稱1次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥量，同時密切觀察大鼠的一般行為及狀態(tài)。

1.7.2 精子密度和精子畸形率 實驗結束后，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動脈采血后，放血處死大鼠，取大鼠附睪，PBS洗凈，眼科剪剪碎，加PBS至2 mL的體積后混勻，37℃水浴加熱5 min，取上清液涂片，顯微鏡下觀察100個精子，計數(shù)活動精子數(shù)，計算精子活動率，精子活動率=活動精子數(shù)/100×100%。37℃水浴加熱20 min后，取上清液，采用血細胞計數(shù)板在顯微鏡下進行精子計數(shù)及形態(tài)學分析，計算精子密度，精子密度=（N×5×10×稀釋倍數(shù)）/mL，N為5個中方格的精子總數(shù)。

1.7.3 性器官指數(shù) 分離睪丸和附睪后，采用電子天平稱量質(zhì)量，計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（g）/體質(zhì)量（g）×100。

1.7.4 腎功能 腹主動脈采血后，1 000 r/min離心10 min，分離取血清，采用全自動生化儀測定血清尿素氮、肌酐含量。

1.7.5 血清睪酮含量 腹主動脈采血后，1000r/min離心10min，分離取血清，采用試劑盒檢測血清睪酮含量。

1.7.6 睪丸組織中SOD和MDA腹主動脈放血處死大鼠后，取同一側(cè)睪丸組織，用生理鹽水在冰浴下勻漿，采用試劑盒檢測組織勻漿中的SOD活性和MDA的含量。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，重復測量數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般狀態(tài)觀察及體質(zhì)量變化正常組大鼠在整個實驗過程中狀態(tài)良好，毛發(fā)正常；與正常組比較，模型組大鼠造模1周后，逐漸出現(xiàn)尿量增多，進食量減少，反應遲鈍，體毛稀疏等癥狀；男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠治療后狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，尿量恢復正常。

給藥前各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。給藥后1周，與正常組比較，模型組、男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠體質(zhì)量整體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即存在分組效應，與正常組比較，模型組、男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠的體質(zhì)量明顯降低（P＜0.01），但男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠體質(zhì)量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組大鼠在給藥前后的各時間點體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），即存在時間效應；時間因素與分組因素存在交互效應（P＜0.05）。（見表1）分組與時間交互效應輪廓圖見圖1。

表1 各組大鼠大鼠體質(zhì)量比較（±s）

表1 各組大鼠大鼠體質(zhì)量比較（±s）

注：F時間主效應=888.238，P時間主效應=0.000；F分組主效應=7.516，P分組主效應=0.000；F交互效應=112.154；P交互效應=0.000；與正常組比較，aP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） 給藥前 給藥后1周 給藥后4周 F P正常組 10 - 251.20±11.63 301.60±24.07 410.20±29.56 124.667 0.000模型組 10 - 258.20±15.52 283.00±17.65 295.10±23.20a 9.732 0.001淫羊藿苷低劑量組 10 5 254.20±14.07 277.90±20.84 286.90±24.95a 6.824 0.004淫羊藿苷中劑量組 10 10 254.20±13.07 280.80±32.07 294.00±20.76a 7.561 0.002淫羊藿苷高劑量組 10 20 256.70±20.21 275.80±26.11 286.30±27.83a 3.701 0.038男寶膠囊組 10 350 254.40±14.63 276.10±21.71 301.20±35.81a 8.347 0.002 F 0.245 1.625 30.935 P 0.941 0.169 0.000

圖1 體質(zhì)量組別與時間交互效應輪廓圖

2.2 各組大鼠精子密度和精子活動率比較與正常組比較，模型組大鼠精子密度和精子活動率均明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠精子密度和精子活動率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與男寶膠囊組比較，淫羊藿苷低、中劑量組大鼠精子密度和精子活動率均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高劑量組大鼠精子密度和精子活動率與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠精子密度和精子活動率比較（±s）

表2 各組大鼠精子密度和精子活動率比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與男寶膠囊組比較，dP＜0.05，eP＜0.01

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 精子密度（106/mL） 精子活動率（%）正常組 10 - 60.24±11.32 80.27±12.56模型組 10 - 32.45±7.56a 34.81±6.24a淫羊藿苷低劑量組10 5 41.63±14.31be 42.27±9.30be淫羊藿苷中劑量組10 10 46.87±12.57cd 52.36±13.41cd淫羊藿苷高劑量組10 20 54.21±15.04c 62.64±7.86c男寶膠囊組 10 350 51.34±12.13c 58.26±9.12c

2.3 各組大鼠性器官指數(shù)比較與正常組比較，模型組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)有降低的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，男寶膠囊組和淫羊藿苷中、高劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與男寶膠囊組比較，淫羊藿苷低、中劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高劑量組大鼠睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠性器官指數(shù)比較（±s）

表3 各組大鼠性器官指數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與男寶膠囊組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） 睪丸指數(shù) 附睪指數(shù)正常組 10 - 0.37±0.05 0.145±0.02模型組 10 - 0.35±0.04 0.130±0.02淫羊藿苷低劑量組10 5 0.38±0.04d 0.142±0.03d淫羊藿苷中劑量組10 10 0.40±0.05b c 0.156±0.03a c淫羊藿苷高劑量組10 20 0.44±0.05b 0.158±0.03b男寶膠囊組 10 350 0.45±0.03b 0.163±0.02b

2.4 各組大鼠腎功能比較與正常組比較，模型組大鼠腎功能減退非常明顯，肌酐和尿素氮兩項指標均明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，男寶膠囊組和淫羊藿苷中、高劑量組大鼠肌酐和尿素氮水平均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與男寶膠囊組比較，淫羊藿苷低、中劑量組大鼠肌酐均明顯升高（P＜0.05），淫羊藿苷低劑量組大鼠尿毒氮明顯升高（P＜0.05），淫羊藿苷中劑量組大鼠尿毒氮明顯降低（P＜0.05）；淫羊藿苷高劑量組大鼠肌酐和尿素氮水平與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠腎功能比較（±s）

表4 各組大鼠腎功能比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與男寶膠囊組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只） 劑量（mg/kg）尿素氮（mmol/L）肌酐（μmol/L）正常組 10 - 5.74±0.67 24.12±3.25模型組 10 - 61.25±12.36c 260.23±65.48a淫羊藿苷低劑量組10 5 56.28±13.65d 240.10±57.50b d淫羊藿苷中劑量組10 10 42.61±10.87c d 220.72±60.17c d淫羊藿苷高劑量組10 20 36.53±9.04c d 185.64±51.83c男寶膠囊組 10 350 45.20±8.86c 190.32±48.26c

2.5 各組大鼠血清睪酮含量比較與正常組比較，模型組大鼠血清睪酮含量明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，男寶膠囊組和淫羊藿苷低、中、高劑量組大鼠血清睪酮含量均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與男寶膠囊組比較，淫羊藿苷低、中劑量組大鼠血清中睪酮含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；淫羊藿苷高劑量組大鼠血清中睪酮含量與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠血清睪酮含量比較（±s）

表5 各組大鼠血清睪酮含量比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與男寶膠囊組比較，dP＜0.05，eP＜0.01

組別 動物數(shù)（只） 給藥劑量（mg/kg） 睪酮（ng/mL）正常組 10 - 0.84±0.22模型組 10 - 0.37±0.13a淫羊藿苷低劑量組10 5 0.45±0.16b e淫羊藿苷中劑量組10 10 0.63±0.24c d淫羊藿苷高劑量組10 20 0.86±0.34c男寶膠囊組 10 350 0.75±0.29c

2.6 各組大鼠睪丸組織中SOD活性和MDA含量比較與正常組比較，模型組大鼠睪丸組織中SOD活性明顯降低（P＜0.01），而MDA含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，男寶膠囊組和淫羊藿苷中、高劑量組大鼠睪丸組織中SOD活性均明顯升高（P＜0.01），MDA含量均明顯降低（P＜0.01）；與男寶膠囊組比較，淫羊藿苷劑低量組大鼠睪丸組織中SOD活性明顯降低（P＜0.05），MDA含量明顯升高（P＜0.05）；淫羊藿苷中劑量組大鼠睪丸組織中SOD活性和MDA含量與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；淫羊藿苷高劑量組大鼠睪丸組織中MDA含量明顯低于男寶膠囊組（P＜0.05），但SOD活性與男寶膠囊組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（見表6）

表6 各組大鼠睪丸組織中SOD活性和MDA含量比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.05，cP＜0.01；與男寶膠囊組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）SOD（U/g）MDA（nmol/mg）正常組 10 - 120.35±31.41 3.54±0.68模型組 10 - 62.60±24.10a 7.87±1.25a淫羊藿苷低劑量組10 5 70.18±25.35d 6.13±0.87d淫羊藿苷中劑量組10 10 85.24±32.62c 5.21±0.92c淫羊藿苷高劑量組10 20 93.36±36.58c 4.23±0.36c d男寶膠囊組 10 350 89.27±26.28c 5.62±0.45c

3 討 論

淫羊藿又名仙靈脾，最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有“益精氣，堅筋骨，補腰膝”的功效[7]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分之一，目前已經(jīng)有較多文獻報道了其對生殖系統(tǒng)具有廣泛的藥理作用[5-6]，但尚無淫羊藿苷對少精子癥影響的相關研究報道。因此，本研究以腺嘌呤制備少精子癥大鼠模型，研究了淫羊藿苷對少精子癥大鼠的治療作用及可能的機制。

腺嘌呤是制作慢性腎臟功能衰竭動物模型的常用試劑[8]，但研究發(fā)現(xiàn)它可通過誘發(fā)肝腎功能損害，造成雄性大鼠睪丸生成精子的功能障礙。目前，腺嘌呤誘導的少精子癥大鼠模型是少精子型不育癥藥效學研究的常用模型之一[9]。男寶膠囊臨床用于補腎壯陽，文獻報道其對少精子癥模型大鼠的生殖功能具有良好的保護作用[10]，故本研究采用男寶膠囊為陽性對照藥。

有研究表明，采用腺嘌呤造模后，大鼠睪丸中的精子數(shù)量明顯減少，精子活動率明顯降低，血清中睪酮表達水平降低[11]。本研究中，250 mg/kg腺嘌呤給藥4周后，模型組大鼠精子密度和精子活動率均明顯低于正常組，血清中睪酮含量也明顯降低，與文獻報道相符，說明少精子癥模型造模成功。本實驗中，淫羊藿苷干預后大鼠精子密度、精子活動率、性器官指數(shù)及血清睪酮含量均升高。另外，還發(fā)現(xiàn)淫羊藿苷對腎臟功能指標有明顯的改善作用，結果表明淫羊藿苷對少精子癥模型大鼠具有良好的治療作用。

男性發(fā)生精子異常的發(fā)病機制之一，就是抑制機體抗氧化酶的活性或者增加活性氧自由基（ROS）的水平[12]，產(chǎn)生氧化應激狀態(tài)。過量的ROS會破壞精子核內(nèi)DNA的完整性和線粒體的結構和功能，促進生殖細胞的凋亡，進而影響受精率?？寡趸瘎糜谏倬影Y的主要作用就是減少ROS對精子的刺激作用，減少氧化應激造成的睪丸損傷[13]。目前，已有文獻報道，淫羊藿苷是一種抗氧化劑，具有較強的抗氧化作用[14-15]。本研究中，腺嘌呤誘導的少精子癥大鼠睪丸組織中的SOD活性降低，而MDA含量升高，表明腺嘌呤造模后導致大鼠睪丸組織中抗氧化成分減少，產(chǎn)生氧化應激，這與文獻報道的情況一致。少精子癥大鼠經(jīng)淫羊藿苷治療后，大鼠睪丸組織中的SOD活性升高，而MDA含量降低，表明淫羊藿苷可能通過減輕少精子癥模型大鼠睪丸組織中的氧化應激狀態(tài)從而產(chǎn)生生殖保護作用。

綜上所述，淫羊藿苷對少精子癥大鼠具有良好的治療作用，其機制可能與改善睪丸組織中的氧化應激水平有關。