寇戰(zhàn)利，陳社論，劉冰林

（咸陽市第一人民醫(yī)院，陜西 咸陽 712000）

2型糖尿病為現(xiàn)代人最常見的全身代謝性疾病之一，患病率呈逐年升高趨勢，對人們健康及日常生活影響較大[1]。2型糖尿病發(fā)展過程中可產(chǎn)生長期、嚴重并發(fā)癥，如骨質疏松。研究顯示2型糖尿病患者患骨質疏松的風險偏高，且可隨年齡增長而持續(xù)提升[2]。目前關于2型糖尿病伴發(fā)骨質疏松的病理生理機制尚處于探索階段，主要通過降血糖、增加骨密度控制病情，但療效未能達到預期[3]。地黃多糖為地黃的有效成分之一，可調節(jié)機體糖脂代謝、降血糖、增強免疫力等[4]。然而，有關地黃多糖對2型糖尿病治療及其骨代謝狀態(tài)調節(jié)的報道鮮見。本研究通過觀察2型糖尿病模型大鼠骨代謝變化，分析地黃多糖對2型糖尿病大鼠骨代謝的調節(jié)作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物7周齡SPF級雄性健康SD大鼠65只，體質量260～270 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。排除代謝性疾病，標準飼料喂養(yǎng)，內含鈣1.1%、磷0.61%，自由攝食水，室溫22～26℃，空氣濕度40～50%，自然光照，換氣風扇通風，適應性飼養(yǎng)1周后開始造模、實驗。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 藥物與試劑地黃多糖（武漢卡諾斯科技有限公司，批號：20200711，純度：99%）；血糖試劑盒（批號：20190511）、鏈脲佐菌素及其相關試劑（批號：20200501）均購自美國Sigma公司；蒽酮試劑（南京化學試劑股份有限公司，批號：20200611）；血鈣、血磷、血堿性磷酸酶測定試劑盒（南京建成生物工程研究所有限公司，批號：20191105，20191108，20191124）；乙二胺四乙酸（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，EDTA，批號：20190621）；兔抗大鼠β-連環(huán)蛋白（β-catenin）（批號：201912114）、成骨特異性轉錄因子抗體（runtrelatedtranscription factor2，Runx2）（批號：20190521）、低密度脂蛋白受體相關蛋白5（low densitylipoprotein recept or related-protein 5，LRP5）（批 號：20190314）、β-actin單克隆抗體（一抗）（批號：20191130）均購自美國Cell signaling technology公司；辣根過氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔IgG二抗、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：20190705）、蛋白酶抑制劑的組織裂解液（批號：20190924）均購自北京碧云天公司；骨組織蛋白提取試劑盒（上海貝博生物有限公司，批號：20191021）；ECL化學發(fā)光試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：20200129）；PVDF膜（美國Millipore公司，批號：20200104）。

1.3 主要儀器NYW-96M全自動酶標儀（北京諾亞威儀器儀表有限公司）；UltraFocus雙能X射線實驗動物骨密度測定儀（美國Faxitron公司）；AU5800全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

1.4 造模與分組65只大鼠選取10只作為空白組，堅持采用標準飼料喂養(yǎng)，其余55只制作2型糖尿病大鼠模型[5]，采用高脂高糖飼料（內含20%蔗糖、20%豬油、60%正常飼料）喂養(yǎng)8周，空腹12 h，經(jīng)腹腔注射鏈脲佐菌素（取1 g鏈脲佐菌素溶入250 mL檸檬酸鹽緩沖液，充分溶解后立即使用）30 mg/kg，空白組大鼠腹腔注射等體積檸檬酸鹽緩沖液（檸檬酸三鈉3.02g、檸檬酸3.1 g以雙蒸水溶解，定容至250 mL）。造模大鼠繼續(xù)以高脂高糖飼料喂養(yǎng)3d后，斷尾取血，空腹血糖濃度≥11.1mmol/L，體質量≥500 g，為暫時成模大鼠，剔除不達標大鼠，1周后復測，空腹血糖濃度≥11.1 mmol/L，體質量≥500 g，即為造模成功。最終44只大鼠造模成功，成模率為80%。將造模成功大鼠隨機分為模型組、地黃多糖低劑量組、地黃多糖高劑量組、二甲雙胍組，每組11只。

1.5 實驗給藥參考《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比率表》確定地黃多糖低、高劑量分別為100、200 mg/（kg·d）。地黃多糖低、高劑量組大鼠分別按100、200 mg/（kg·d）劑量灌胃地黃多糖溶液，0.2mL/次，1次/d；二甲雙胍組大鼠按200mg/（kg·d）劑量灌胃二甲雙胍溶液，0.2 mL/次，1次/d；模型組、空白組大鼠灌胃等體積檸檬酸鹽緩沖液，0.2 mL/次，1次/d，連續(xù)給藥8周。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠骨密度測定 給藥第8周末，大鼠禁食24 h后稱量，采用3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，將麻醉大鼠平置于X線骨密度掃描儀上，軟件掃描記錄大鼠脛骨骨密度，檢測3次，取平均值。

1.6.2 大鼠血糖、胰島素、肝糖原含量測定 大鼠末次完成骨密度測試后，休息3 d，禁食6 h，3%戊巴比妥鈉麻醉，剖腹后，腹主動脈取血8 mL，4 000 r/min離心5 min，半徑10 cm，分離血漿，取上清液，過柱層析后置-20℃冰箱中保存待檢。脫頸處死大鼠，取出雙側脛骨，仔細刮除表面肌肉、筋膜等軟組織，-80℃條件下保存，用于后續(xù)骨組織形態(tài)觀察以及蛋白檢測。取大鼠肝臟，入液氮冰凍備用。（1）采用全自動生化分析儀檢測大鼠空腹血糖，嚴格根據(jù)試劑盒說明書進行；（2）酶聯(lián)免疫吸附法檢測胰島素：在預先包被的大鼠胰島素捕獲抗體的包被微孔中依次加入血清標本、標準品、HRP標記的胰島素抗體，溫育后洗滌，底物TMB顯色，氧化物酶催化下轉化為藍色，酸作用下轉化為最終黃色，顏色深淺與胰島素正相關，酶標儀450 nm波長下檢測吸光度值，計算胰島素濃度；（3）蒽酮法檢測肝糖原含量：稱取0.5 g肝組織置勻漿器，加入2%三氯乙酸溶液3 mL，勻漿。取勻漿液1 mL，置入10 mL刻度試管內，加入10 mol/mL KOH 1 mL，沸水煮1 h。取出冷卻，加入0.5 mL冰醋酸，加水到10 mL，以10 mL容量瓶配置濃度不同的葡萄糖標準液。取上述溶液1 mL置入試管，移至冰水浴，加入蒽酮試劑2 mL，搖勻冷卻后置入沸水浴，6 min后取出置入冰水浴冷卻。記錄分光光度計650 nm波長處OD值，繪制葡萄糖標準曲線圖，計算標準曲線方程：y=0.008 5x-0.000 2，相關系數(shù)r=0.999 7。

1.6.3 大鼠血清骨代謝標志物測定 取“1.6.2”血清，參考試劑盒說明書檢測血鈣、血磷、堿性磷酸酶。比色法檢測血鈣：制備鈣顯色工作液，即現(xiàn)配CA 19-9 Assay buffer和TMB顯色液等量混合，選用一次性無菌聚乙烯離心管，依次加入ddH2O、鈣標準品、檢測樣品、鈣顯色工作液，混勻后室溫靜置，分光光度計610 nm處，比色杯光徑1.0 cm，讀取吸光度值，計算血鈣濃度。磷鉬酸法測定血磷：常規(guī)制備血濾液，即取血清0.2 mL，加入三氯醋酸-硫酸試劑4.8 mL，標準管加入磷標準液0.2 mL，加入三氯醋酸-硫酸亞鐵試劑4.8 mL，混勻靜置10 min，3 000 r/min離心5 min，取上清，進行顯色反應，用波長640 nm比色，讀取吸光度值，計算血磷濃度。酶聯(lián)免疫吸附法檢測堿性磷酸酶，操作過程同胰島素檢測方法。

1.6.4 HE染色觀察骨組織病理學變化 大鼠左側脛骨在4%多聚甲醛中固定24 h，置入EDTA脫鈣液室溫靜置10 d，隔天更換1次脫鈣液，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋，制作4 μm后切片，置入60℃烘箱內烘干，4℃保存。取出切片，提前60℃烘2 h以上，避免掉片，常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精水化，蘇木素染液1 min，自來水快速漂洗至無色，1%鹽酸酒精分化10 s，自來水漂洗至無色，再浸泡20 min，鏡下觀察蘇木素染色，可見細胞核呈藍紫色，細胞間質無著色，伊紅染色1 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察大鼠骨組織病理學。

1.6.5 大鼠脛骨中Wnt通路相關蛋白表達測定 取大鼠右側脛骨，采用錘式組織粉碎器將脛骨打碎為小塊骨組織，取200 mg左右骨組織碎片，置入加有液氮的研缽中研磨成粉末，加入含蛋白酶抑制劑的1 mL組織裂解液，在Buffer勻漿機內研碎勻漿，4℃條件3 000 g離心25 min，取勻漿上清。BCA法檢測蛋白濃度，待測樣品稀釋至相同蛋白濃度，取各個樣本20 μL，SDS-PAGE凝膠電泳，轉PVDF膜，5%脫脂牛奶中封閉1.5 h，將PVDF膜置入兔抗大鼠β-catenin、Runx2、LRP5、β-actin抗體（一抗，濃度1∶1 000）中孵育，4℃搖床過夜，PBST清洗，加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（濃度1∶2 000），避光孵育1.5 h，ECL顯色，觀察條帶，壓片。將膜置于凝膠成像系統(tǒng)中掃描拍照，分析數(shù)據(jù)，以待測蛋白與內參蛋白的灰度值比值表示待測蛋白相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，如Levene檢驗方差齊，采用單因素方差分析，再用LSD-t檢驗行兩兩比較，如Levene檢驗方差不齊，改用Welch檢驗，再用Dunnett's T3法進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠的脛骨骨密度比較模型組大鼠的脛骨骨密度低于空白組（P＜0.05）；地黃多糖低劑量組、地黃多糖高劑量組和二甲雙胍組大鼠的脛骨骨密度均高于模型組（P＜0.05）；地黃多糖低、高劑量組大鼠的脛骨骨密度均低于二甲雙胍組（P＜0.05）；地黃多糖高劑量組大鼠的脛骨骨密度高于地黃多糖低劑量組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠的脛骨骨密度比較（±s，g/cm2）

表1 各組大鼠的脛骨骨密度比較（±s，g/cm2）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地黃多糖低劑量組比較，cP＜0.05；與地黃多糖高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg） 骨密度空白組 10 - 0.22±0.02模型組 11 - 0.13±0.01a地黃多糖低劑量組 11 100 0.15±0.02a b地黃多糖高劑量組 11 200 0.17±0.01a b c二甲雙胍組 11 200 0.19±0.02a b c d F 64.788 P 0.000

2.2 各組大鼠的血糖、胰島素、肝糖原比較模型組大鼠血糖高于空白組（P＜0.05），胰島素含量、肝糖原含量低于空白組（P＜0.05）；地黃多糖低劑量組、地黃多糖高劑量組和二甲雙胍組大鼠血糖均低于模型組（P＜0.05），胰島素含量、肝糖原含量均高于模型組（P＜0.05）；地黃多糖低、高劑量組大鼠血糖均高于二甲雙胍組（P＜0.05），胰島素含量、肝糖原均低于二甲雙胍組（P＜0.05）；地黃多糖高劑量組大鼠血糖低于地黃多糖低劑量組（P＜0.05），胰島素含量、肝糖原含量高于地黃多糖低劑量組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血糖、胰島素、肝糖原含量比較（±s）

表2 各組大鼠血糖、胰島素、肝糖原含量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地黃多糖低劑量組比較，cP＜0.05；與地黃多糖高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）血糖（mmol/L）胰島素（μIU/mL）肝糖原（mg/g）空白組 10 - 4.82±0.36 22.14±0.95 28.47±2.15模型組 11 - 15.98±0.97a 17.48±0.65a 13.28±1.45a地黃多糖低劑量組11 100 10.36±0.45ab 18.75±0.58a b 16.39±0.93a b地黃多糖高劑量組11 200 8.45±0.39a b c 19.98±0.42a b c 19.28±1.05a b c二甲雙胍組 11 200 6.54±0.33a b c d 20.47±0.25a b c d 22.31±1.27a b c d F 64.788 88.684 175.737 P 0.000 0.000 0.000

2.3 各組大鼠骨代謝相關指標比較5組大鼠血鈣含量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；模型組大鼠血磷含量低于空白組（P＜0.05），堿性磷酸酶活性高于空白組（P＜0.05）；二甲雙胍組和地黃多糖低、高劑量組大鼠血磷含量高于模型組（P＜0.05），堿性磷酸酶活性低于模型組（P＜0.05）；地黃多糖高劑量組和二甲雙胍組大鼠血磷含量高于地黃多糖低劑量組（P＜0.05），堿性磷酸酶活性低于地黃多糖低劑量組（P＜0.05）；二甲雙胍組大鼠血磷含量高于地黃多糖高劑量組（P＜0.05），堿性磷酸酶活性低于地黃多糖高劑量組（P＜0.05）。（見表3）。

2.4 各組大鼠脛骨組織病理學改變情況空白組大鼠脛骨骨小梁連續(xù)性、結構完好，骨皮質厚且邊緣光滑，皮質骨內吸收性凹陷少，骨基質均勻；模型組大鼠脛骨骨小梁斷裂，數(shù)量減少，骨皮質薄且邊緣毛糙，骨皮質內有骨吸收性凹陷；與模型組比較，地黃多糖低劑量組、地黃多糖高劑量組和二甲雙胍組大鼠脛骨骨小梁依次增粗、連續(xù)性改善，數(shù)量增加，骨皮質內吸收性凹陷減少，厚度增加。（見圖1）

圖1 各組大鼠脛骨組織病理學變化（HE，×100，比例尺：20 μm）

2.5 各組大鼠骨組織中β-catenin、Runx2、LRP5蛋白表達水平比較模型組大鼠骨組織β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量低于空白組（P＜0.05）；二甲雙胍組和地黃多糖低、高劑量組大鼠骨組織β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量均高于模型組（P＜0.05）；地黃多糖高劑量組和二甲雙胍組大鼠骨組織β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量均高于地黃多糖低劑量組（P＜0.05）；二甲雙胍組大鼠骨組織β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量均高于地黃多糖高劑量組（P＜0.05）。（見表3、圖2）。

表3 各組大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶水平比較（±s）

表3 各組大鼠血鈣、血磷、堿性磷酸酶水平比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地黃多糖低劑量組比較，cP＜0.05；與地黃多糖高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）血鈣（mmol/L）血磷（mmol/L）堿性磷酸酶（U/L）空白組 10 - 2.77±0.21 1.93±0.05 102.55±18.92模型組 11 - 2.69±0.27 1.51±0.02a 258.43±24.17a地黃多糖低劑量組11 100 2.72±0.26 1.63±0.03a b 180.36±19.44a b地黃多糖高劑量組11 200 2.74±0.27 1.75±0.02a b c 151.39±18.67a b c二甲雙胍組 11 200 2.68±0.23 1.84±0.03a b c d 133.28±12.53a b c d F 0.228 297.978 103.088 P 0.922 0.000 0.000

表3 各組大鼠骨組織中β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠骨組織中β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與地黃多糖低劑量組比較，cP＜0.05；與地黃多糖高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（mg/kg）β-catenin Runx2 LRP5空白組 10 - 1.18±0.21 1.15±0.19 1.22±0.15模型組 11 - 0.33±0.04a 0.36±0.05a 0.40±0.07a地黃多糖低劑量組11 100 0.55±0.06ab 0.51±0.07ab 0.56±0.08ab地黃多糖高劑量組11 200 0.75±0.09abc 0.69±0.05abc 0.88±0.09abc二甲雙胍組 11 200 0.88±0.05abcd 0.99±0.12abcd 0.92±0.06abcd F 96.987 98.431 124.024 P 0.000 0.000 0.000

圖2 各組大鼠骨組織中β-catenin、Runx2、LRP5蛋白表達Western blotting圖

3 討 論

2型糖尿病是糖尿病主要類型，目前認為其是環(huán)境、遺傳因素導致外周組織胰島素抵抗、胰島素分泌缺陷、胰島素不足，葡萄糖攝取量減少引發(fā)的內分泌疾病[6]。2型糖尿病可導致骨質改變，因此臨床在治療2型糖尿病的同時，亦高度重視調節(jié)骨代謝。中醫(yī)近數(shù)十年來基于中醫(yī)藥理論，利用現(xiàn)代科技，加強了對2型糖尿病治療藥物的研發(fā)，其中多數(shù)使用地黃進行組方，并經(jīng)長期實踐證明地黃多糖有降血糖、增強免疫、抗衰老、抗腫瘤等多方面功效，且在治療患者骨質疏松方面亦有一定功效[7]。

本研究結果表明，與模型組比較，地黃多糖低、高劑量組大鼠血糖水平降低，胰島素、肝糖原水平升高，提示地黃多糖給藥8周后可有效抑制血糖升高，并提高胰島素、肝糖原水平，尤其是地黃多糖高劑量組效果尤為明顯，分析其機制可能為地黃多糖通過促進胰島素分泌，增加肝糖原生成，發(fā)揮降血糖效應，最終改善糖代謝。糖尿病性骨質疏松是繼發(fā)性骨質疏松，由內分泌代謝紊亂所致，動物實驗指出[8]，糖尿病大鼠骨代謝初期表現(xiàn)為成骨細胞功能下降、破骨細胞功能增強，造成骨吸收大于骨形成，誘發(fā)骨重建失衡，最終形成骨質疏松。骨密度屬于骨形成標記，不但反映骨量，還反映骨礦化程度[9]。本研究結果顯示：地黃多糖干預可增加大鼠骨密度，提示地黃多糖有助于增加骨量，發(fā)揮抗骨質疏松作用。血鈣、血磷、堿性磷酸酶為常用血清骨代謝生物標志物，血鈣升高一般見于維生素D過量、甲狀旁腺機能亢進等情況，下降則見于佝僂病、慢性腎炎尿毒癥等情況，而骨質疏松者往往無異常[10]。血磷可促進骨基質形成，加速礦物質沉積，若骨吸收加快，血磷水平則明顯下降，在一定程度上可反映骨吸收程度。堿性磷酸酶是成骨細胞表型標志物，也是骨形成生化標志物。在本實驗中，與模型組比較，地黃多糖高、低劑量組血鈣無變化，血磷含量升高，堿性磷酸酶活性降低，考慮大鼠處于高血糖狀態(tài)，尿鈣排出可能是骨量丟失的主要原因，予以地黃多糖干預可促進骨基質形成，發(fā)揮抗骨質疏松的作用，其中高劑量干預效果優(yōu)于低劑量。此外，鏡下觀察大鼠脛骨骨皮質、骨小梁發(fā)現(xiàn)，地黃多糖組大鼠骨小梁結構與連續(xù)性，骨皮質厚度，以及內吸收情況改善，進一步提示了地黃多糖在改善2型糖尿病大鼠骨代謝方面的積極作用。

Wnt信號通路是眾多生物過程中基礎信號通路，近期在骨生物學中得到高度關注，目前認為其是骨形成調節(jié)作用機制的新途徑，可影響成骨細胞增殖、凋亡等行為，調控成骨細胞、破骨細胞偶聯(lián)，在骨重建中起到了關鍵作用[11-13]。Wnt信號是糖尿病、骨質疏松發(fā)病的共同因素[14]，Wnt/β-catenin信號通路是最經(jīng)典、最廣受關注的Wnt信號通路之一，是Wnt蛋白與卷曲蛋白（frizzled，F(xiàn)rz）受體結合，進一步與LRP5/LRP6輔助受體結合，觸發(fā)細胞內信號傳導，聚集β-catenin的級聯(lián)反應過程，對骨形成十分關鍵，若Wnt/β-catenin信號通路紊亂，可導致許多骨骼性疾病。β-catenin是Wnt信號通路的中心調控分子，蓄積后可促使體外成骨細胞發(fā)育、體內骨形成[15]；LRP5不同類型突變可導致兩種不同結果：其一是功能喪失性突變，可抑制骨形成，導致骨量減少；其二是功能獲得性突變，可促進骨形成[16]。Runx2是編碼成骨細胞的特異性轉錄因子，可調控成骨細胞分化和骨的形成[17]。Wnt/LRP5/β-catenin通路可影響Runx2表達或活性，即通過激活Runx2表達調節(jié)成骨細胞發(fā)育、骨質形成，因而Wnt信號通路是調節(jié)成骨細胞、骨形成的重要途徑。本研究結果顯示，與模型組比較，地黃多糖高劑量組、地黃多糖低劑量組和二甲雙胍組大鼠骨組織β-catenin、Runx2、LRP5蛋白相對表達量升高，提示經(jīng)地黃多糖、二甲雙胍干預后，可增強2型糖尿病大鼠β-catenin、Runx2、LRP5蛋白表達，從而在骨重建過程中發(fā)揮促進作用。唐思夢等[18]認為二甲雙胍是臨床治療2型糖尿病的基礎藥。邵珠林等[19]報道二甲雙胍可促進2型糖尿病患者骨形成。單新平等[20]經(jīng)動物實驗發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可通過調節(jié)Wnt信號通路抑制2型糖尿病大鼠損傷，推測二甲雙胍在降血糖、調節(jié)骨代謝方面的作用是通過調節(jié)Wnt信號通路實現(xiàn)的，未來有待進一步探討。

綜上所述，地黃多糖可改善2型糖尿病大鼠骨代謝，發(fā)揮抗骨質疏松作用，其機制可能與Wnt通路激活有關。