張秉麗，霍成英，李有連

（青海仁濟(jì)醫(yī)院，青海 西寧 810000）

胃癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，在我國的發(fā)病率與病死率僅次于肺癌與肝癌，居第3位，其發(fā)病率和病死率仍在逐年上升[1]。而且，胃癌早期臨床癥狀不明顯，確診時(shí)多為胃癌中晚期，化療、放療及手術(shù)治療療效不明顯，嚴(yán)重威脅人類生命健康[2]。胃癌患者臨床治療失敗和死亡的主要原因是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。自噬是存在于真核細(xì)胞內(nèi)利用溶酶體降解自身受損細(xì)胞器和大分子物質(zhì)的過程，是細(xì)胞應(yīng)對惡劣環(huán)境的生存機(jī)制，與腫瘤的發(fā)生、增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。重樓皂苷Ⅰ是從中藥重樓中提取的一種小分子單體，屬于甾體皂苷，毒副作用小、抗腫瘤效應(yīng)強(qiáng)，能影響多種腫瘤細(xì)胞和移植瘤的生長[3-4]。研究表明，重樓皂苷Ⅰ通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬能夠抑制胃癌細(xì)胞侵襲能力[5]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）是線粒體自噬標(biāo)記蛋白，參與自噬膜的形成，是自噬形成的標(biāo)志性因子，研究發(fā)現(xiàn)，LC3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartatespecific proteinases 3，Caspases-3）是細(xì)胞凋亡效應(yīng)因子，高表達(dá)可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]。重樓皂苷Ⅰ抑制腫瘤的作用早有報(bào)道，但其發(fā)揮作用的機(jī)制尚不清楚，是否通過調(diào)控自噬與凋亡發(fā)揮作用有待證實(shí)。本研究主要探討重樓皂苷Ⅰ對胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體自噬的作用及對線粒體自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響。

1 材 料

1.1 細(xì)胞系人胃癌SGC-7901細(xì)胞，購買于美國ATCC公司。

1.2 試劑重樓皂苷Ⅰ（成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，純度：95%～99%，規(guī)格：100 mg，批號：180223）；胎牛血清（批號：150712）、1640-RPMI培養(yǎng)基（批號：161124）、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）試劑（批號：180414）均購自美國Gibco公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素（flourescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號：170927）；二甲基亞砜（美國Sigma公司，批號：161117）；兔抗人Beclin-1單克隆抗體（批號：081105）、兔抗人LC3-Ⅰ單克隆抗體（批號：201412）、兔抗人LC3-Ⅱ單克隆抗體（批號：150413）、兔抗人Bcl-2單克隆抗體（批號：101019）、兔抗人Bax單克隆抗體（批號：180522）、兔抗人Caspase-3單克隆抗體（批號：170915）、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔多抗（批號：190308）均購自英國abcam公司。

1.3 主要儀器TE2000-U型倒置生物顯微鏡（日本Nikon公司）；FACSCalibu型流式細(xì)胞儀系統(tǒng)（美國BD公司）。

2 方 法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將SGC-7901胃癌細(xì)胞接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640-RPMI培養(yǎng)基中，置于含5%CO2恒溫37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代一次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 分組及藥物處理用含10%胎牛血清的1640-RPMI液體培養(yǎng)基溶解重樓皂苷Ⅰ，分成重樓皂苷Ⅰ低劑量組、重樓皂苷Ⅰ中劑量組、重樓皂苷Ⅰ高劑量組，分別以質(zhì)量濃度為1.5、3.0、6.0 mg/mL重樓皂苷Ⅰ培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。對照組用含10%胎牛血清的1640-RPMI培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞。

2.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測取對數(shù)生長期SGC-7901細(xì)胞，PBS沖洗，胰酶消化5 min，細(xì)胞密度1×105個(gè)/mL，接種于96孔板。細(xì)胞貼壁后，對照組、重樓皂苷Ⅰ低劑量組、重樓皂苷Ⅰ中劑量組、重樓皂苷Ⅰ高劑量組更換為對應(yīng)的培養(yǎng)基，200μL/孔，分別培養(yǎng)24、48、72h。在各時(shí)間段結(jié)束前4 h每孔加20μL 5mg/mL的MTT溶液，孵育4 h，每孔加150 μL DMSO，充分震蕩10 min，用全自動酶標(biāo)儀檢測490 nm處各孔的吸光度（A）值，每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，計(jì)算增殖抑制率。增殖抑制率=（對照孔A值-藥物孔A值）/對照孔A值×100%。

2.4 透射電鏡觀察SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變?nèi)「鹘M培養(yǎng)72 h的SGC-7901胃癌細(xì)胞加入體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛和1%鋨酸固定細(xì)胞，丙酮脫水，制片，鉛、鈾各復(fù)染10 min，透射電子顯微鏡下對細(xì)胞自噬小體進(jìn)行觀察，拍照。

2.5 Lyso-Tracker Red染色觀察SGC-7901細(xì)胞自噬情況取各組培養(yǎng)72 h的SGC-7901胃癌細(xì)胞，PBS清洗后，暗室中加入50 nmol/L的Lyso-Tracker Red染液，孵育30 min，清洗。加入Hoechst 33342染液再次孵育20 min，清洗后制片，6 h內(nèi)置于熒光顯微鏡下觀察并拍照，鏡下紅色熒光小體為溶酶體。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況取各組培養(yǎng)72 h的SGC-7901胃癌細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞，室溫2 000 r/min離心5 min，離心半徑8 cm，棄上清，用提前預(yù)冷的PBS漂洗后，加入195 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min，加入10 μL PI染色5 min，置于流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。每組均設(shè)5個(gè)復(fù)孔。

2.7 Western blotting法檢測胃癌細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量取各組培養(yǎng)72 h的SGC-7901胃癌細(xì)胞，收集細(xì)胞，提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度，每孔加入蛋白樣品40 μL，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，5%脫脂奶粉孵育1 h，加1∶1 000稀釋的Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗，4℃搖床孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加入1∶4 000相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，搖床室溫孵育2 h。TBST溶液洗膜3次，10 min/次，加ECL超敏發(fā)光液，凝膠成像系統(tǒng)顯影，以目的蛋白和β-actin蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多樣本計(jì)量資料比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 重樓皂苷Ⅰ對細(xì)胞增殖的影響24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率各組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組24、48、72 h細(xì)胞增殖抑制率均升高（P＜0.05），且重樓皂苷Ⅰ高劑量組各時(shí)間細(xì)胞增殖抑制率高于重樓皂苷Ⅰ中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組細(xì)胞增殖抑制率均隨時(shí)間延長而增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 重樓皂苷Ⅰ對細(xì)胞增殖的影響（±s，n=5）

3.2 透射電鏡觀察SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變對照組SGC-7901細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，線粒體形態(tài)、核仁等正常，僅可見少量自噬小體形成；重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組SGC-7901胃癌細(xì)胞橢圓形的雙層膜包繞囊泡狀結(jié)構(gòu)增多，內(nèi)含有各種蛋白及線粒體，自噬小體數(shù)量逐漸增多。（見圖2）

圖2 各組SGC-7901細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)比較

3.3 Lyso-Tracker Red染色觀察SGC-7901細(xì)胞自噬情況Lyso-Tracker Red染色結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組SGC-7901胃癌細(xì)胞溶酶體紅色熒光小體增加，出現(xiàn)酸性自噬溶酶體囊泡過度累積的現(xiàn)象。（見圖3）

圖3 各組SGC-7901細(xì)胞自噬情況比較

3.4 細(xì)胞凋亡率比較細(xì)胞凋亡率組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05），且重樓皂苷Ⅰ高劑量組細(xì)胞凋亡率高于重樓皂苷Ⅰ中劑量組（P＜0.05）。（見表1、圖4）

圖4 各組胃癌SGC-7901細(xì)胞凋亡情況

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=5）

表1 各組細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，bP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，cP＜0.05

組別 凋亡率對照組 2.21±1.32重樓皂苷Ⅰ低劑量組 12.72±1.39a重樓皂苷Ⅰ中劑量組 26.25±2.73a b重樓皂苷Ⅰ高劑量組 38.87±3.22a b c F 36.772 P 0.000

3.5 各組胃癌細(xì)胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ中、高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，重樓皂苷Ⅰ高劑量組Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低（P＜0.05）。（見表2、圖5）

表2 各組胃癌細(xì)胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較（±s，n=5）

表2 各組胃癌細(xì)胞Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量及LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Bcl-2/Bax比值比較（±s，n=5）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ低劑量組比較，bP＜0.05；與重樓皂苷Ⅰ中劑量組比較，cP＜0.05

組別 Beclin-1 Caspase-3 LC3-Ⅰ/LC3-ⅡBcl-2/Bax對照組 0.39±0.06 0.41±0.05 1.13±0.12 1.27±0.13重樓皂苷Ⅰ低劑量組0.52±0.07a 0.65±0.07a 0.83±0.09a 0.96±0.10a重樓皂苷Ⅰ中劑量組0.88±0.09ab 0.91±0.10ab 0.63±0.07ab 0.82±0.09ab重樓皂苷Ⅰ高劑量組1.14±0.11abc 1.16±0.13abc 0.38±0.04abc 0.53±0.06abc F 36.773 42.383 28.427 39.036 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖5 各組胃癌細(xì)胞Beclin-1、Caspase-3、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)Western blotting圖

4 討 論

胃癌是源于胃黏膜上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，由多種因素引起，慢性胃炎等胃部疾病，或幽門螺桿菌感染，以及不良飲食習(xí)慣、環(huán)境和遺傳等多種因素的共同作用，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種中藥活性成分具有抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，臨床上使用中藥治療惡性腫瘤療效顯著，可改善化療后毒性反應(yīng)，使用安全且不良反應(yīng)較小，具有廣闊的應(yīng)用前景[8]。臨床研究證實(shí)，重樓皂苷Ⅰ可誘導(dǎo)肝癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌及子宮癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞凋亡，具有顯著的抗癌作用，探討重樓皂苷Ⅰ抗癌機(jī)制，對于提高腫瘤患者生存率意義重大[9-10]。

重樓皂苷Ⅰ主要提取自百合科植物云南重樓或七葉一枝花干燥根莖，藥理學(xué)活性較廣泛，包括抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)心血管等，且能抑制腫瘤細(xì)胞增殖。線粒體自噬是細(xì)胞清除體內(nèi)損傷線粒體及維持自身穩(wěn)態(tài)的一種重要調(diào)節(jié)機(jī)制，為細(xì)胞應(yīng)對惡劣環(huán)境的生存機(jī)制，在腫瘤發(fā)生、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮重要作用，且受多種調(diào)控因子影響[5]。近年來，重樓皂苷Ⅰ的臨床研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞自噬，以發(fā)揮抗腫瘤作用。WANG W P等[11]研究表明重樓皂苷Ⅰ不僅能誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞出現(xiàn)Caspase依賴的線粒體途徑凋亡，還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞線粒體自噬，影響細(xì)胞內(nèi)自噬標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。陳舒怡等[12]發(fā)現(xiàn)重樓皂苷Ⅰ可通過線粒體碎裂，誘導(dǎo)人肺癌NCI-H661細(xì)胞凋亡。這些研究均提示重樓皂苷Ⅰ可能在腫瘤細(xì)胞線粒體自噬中發(fā)揮重要作用，但目前臨床就重樓皂苷Ⅰ對胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體自噬作用仍無明確定論。本研究結(jié)果顯示，重樓皂苷Ⅰ各劑量組給藥后細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率均顯著升高，自噬小體及自噬溶酶體數(shù)量增多，這提示重樓皂苷Ⅰ可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，促進(jìn)線粒體自噬，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

LC3是哺乳動物細(xì)胞中酵母ATG8基因的同源物，包括Ⅰ型與Ⅱ型。發(fā)生自噬時(shí)，LC3-I脂質(zhì)化形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合并定位在胞內(nèi)自噬體膜上。LC3-Ⅱ含量與自噬體數(shù)量呈正比，是自噬起始階段的分子標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，低濃度H2O2能促進(jìn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖，白藜蘆醇可抑制類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與降低自噬蛋白LC3-I/II、Beclin-1表達(dá)有關(guān)[13]。Caspases家族是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵元件，其激活與過表達(dá)會引起細(xì)胞凋亡，并通過與眾多蛋白因子相互作用調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]。Caspase-3處于凋亡有序級聯(lián)反應(yīng)的下游，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者與主要效應(yīng)因子，是多種凋亡刺激信號傳遞的匯聚點(diǎn)，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志[15]。劉文粵等[16]發(fā)現(xiàn)藤黃酸能夠誘導(dǎo)Caspase-3活性促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌TE-1細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)胞漿轉(zhuǎn)導(dǎo)肽介導(dǎo)抑癌基因?qū)肽I癌786-O細(xì)胞中，并對腎癌786-O細(xì)胞有明顯的抑制作用，可能是通過影響B(tài)ax-Caspase-3凋亡通路的活性，抑制786-O細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮抑癌作用[17]。本研究中重樓皂苷Ⅰ低、中、高劑量組與對照組比較，Beclin-1、Caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高，Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值降低，且效果呈劑量依賴性，提示重樓皂苷-Ⅰ能促進(jìn)人胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體自噬，可通過上調(diào)Beclin-1、Caspase-3的表達(dá)，降低Bcl-2/Bax、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ比值，誘導(dǎo)自噬，促進(jìn)凋亡，發(fā)揮抗癌作用。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞線粒體自噬，可能是通過調(diào)控凋亡及自噬相關(guān)基因，上調(diào)Caspase-3，降低LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ發(fā)揮作用。