陳慧，常瑛，劉振國(guó)

西北婦女兒童醫(yī)院藥劑科臨床藥學(xué)室，西安 710000

由于早期癥狀不明顯、發(fā)現(xiàn)晚、預(yù)后差，胰腺癌已經(jīng)成為全球病死率最高的惡性腫瘤之一。迄今為止，胰腺癌的臨床治療策略仍僅局限于手術(shù)切除、化療和放療等傳統(tǒng)的治療方法，治療效果不理想。因此，尋找更加有效的治療策略對(duì)胰腺癌的治療至關(guān)重要。

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展有明顯進(jìn)步，研究者開始從分子和基因水平研究胰腺癌發(fā)生發(fā)展。PIM3作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在胰腺癌中異常表達(dá)，主要通過(guò)磷酸化特異性底物使其失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞增殖增多、凋亡減少，表現(xiàn)為細(xì)胞增殖相關(guān)的分子Ki-67的表達(dá)升高，促凋亡分子的表達(dá)上調(diào)，如B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2），而抑制凋亡相關(guān)的分子的表達(dá)下調(diào)，如Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3，最終促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但目前關(guān)于PIM3在胰腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中作用的研究較少。RNA沉默技術(shù)，作為一種重要的基因調(diào)控機(jī)制越來(lái)越受到臨床的重視，包括小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。因此，本研究通過(guò)設(shè)計(jì)和合成

PIM3

siRNA，體外轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，觀察抑制

PIM3

的表達(dá)對(duì)胰腺癌細(xì)胞AsPC-1增殖和凋亡的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、動(dòng)物、主要試劑和儀器

人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。裸鼠購(gòu)自北京華阜康生物有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自浙江天杭生物公司，0.25%胰蛋白酶購(gòu)自上海生工生物有限公司，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl terazolium，MTT）購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司，

Ki-67

、

Bcl-2

、

BAX

、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物均于華大基因公司合成，Jet PRIME DNA&siRNA體外轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Polyplus公司，山羊抗兔β-actin單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗兔PIM3單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司，T7體外逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)TakaRa公司。Galius FACS流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)貝克曼公司，Rotor-Gene 6000熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Corbett Research公司，HBS-1101酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀況良好的人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞接種至6孔板中，1×10/孔，待細(xì)胞貼壁增殖至50%左右，將加入抗生素的RPMI 1640培養(yǎng)基換成無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。利用轉(zhuǎn)染試劑Jet PRIME，將

scramble

siRNA（陰性對(duì)照，10 μg）和

PIM3

siRNA（干擾

PIM3

的表達(dá)，10 μg）分別轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，分別作為scramble-siRNA組和PIM3-siRNA組，以1×磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）作為溶劑對(duì)照，將100 μl的PBS轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞，作為溶劑對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6～8 h后將無(wú)抗生素的DMEM培養(yǎng)基換成加入抗生素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h（用于實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)）或72 h[用于蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)]。1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞

PIM3

、

Bcl-2

、

BAX

、

Ki-67

、

caspase3

mRNA的相對(duì)表達(dá)量 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scramblesiRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對(duì)照組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞接種于96孔板中，1×10/孔，培養(yǎng)48 h后PBS充分洗滌后，參照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA。按照說(shuō)明書配制反應(yīng)體系：dNTP mix（4 μl）、primer mix（2 μl）、RNA 和 RNase-free wate（r最高13 μl），用70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min。繼續(xù)向反應(yīng)液中加入以下試劑：5×RT Buffe（r4 μl）、DTT（2 μl）和HiFi Scrip（t1 μl），50℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄得到的 cDNA進(jìn)一步擴(kuò)增，加入cDNA（4 μl）、SYBR Green mix（8 μl）、正向引物（2 μl）、反向引物（2 μl）。PCR反應(yīng)：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃45 s，50個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保持。以

GAPDH

為內(nèi)參，2法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。各基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.2.3 MTT 法檢測(cè)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對(duì)照組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞接種于96孔板中，1×10/孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入MTT試劑10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，離心，去上清，加入 100 μl 二 甲 基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570和OD630各孔的吸光度以O(shè)D630為校正值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=[1-（實(shí)驗(yàn)組-空白對(duì)照組）（/陰性對(duì)照組-空白對(duì)照組）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對(duì)照組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡能力，參照說(shuō)明書操作，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。將Annexin V與PI聯(lián)合使用時(shí)，早期凋亡細(xì)胞被標(biāo)記為Annexin VPI，而晚期凋亡細(xì)胞呈雙陽(yáng)性Annexin VPI，本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)前期凋亡和晚期凋亡的綜合凋亡比例。

1.2.5 Western blot 法檢測(cè)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞PIM3、Bcl-2、BAX、caspase3蛋白的相對(duì)表達(dá)量取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的scramble-siRNA組、PIM3-siRNA組和溶劑對(duì)照組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，收集細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說(shuō)明書提取總蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離，然后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在 5%的脫脂牛奶中，室溫下?lián)u動(dòng)封閉1 h。然后加入TBST洗滌3次，每次10 min，加入一抗（山羊抗兔PIM3、β-actin單克隆抗體，稀釋比例均為1∶1000），4℃過(guò)夜孵育。在室溫下洗膜，加入二抗（2%的脫脂牛奶按照1∶2000的比例稀釋），室溫孵育1 h。洗滌3次，每次10 min。最后進(jìn)行發(fā)光顯影，Image J軟件分析蛋白表達(dá)灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算PIM3蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 皮下荷瘤小鼠模型的建立及治療 30只6周齡雄性非肥胖糖尿病/嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（nonobesediabetic/severecombined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠，體重（20±1）g，全部飼養(yǎng)于SPF級(jí)環(huán)境中。常規(guī)收集AsPC-1細(xì)胞并計(jì)數(shù)，于每只小鼠腋下左側(cè)荷1×10個(gè)細(xì)胞，1周后，所有小鼠均有腫瘤出現(xiàn)。隨后將30只荷瘤小鼠隨機(jī)分為control組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組10只，control組小鼠瘤內(nèi)注射 1×PBS 共 100 μl，陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組小鼠瘤內(nèi)分別注射25 μg的

scramble

siRNA和

PIM3

siRNA，100 μl體系。各組小鼠均治療4次后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)和寬，計(jì)算腫瘤體積=長(zhǎng)×寬/2，處死小鼠，取出腫瘤，進(jìn)行稱重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PIM3mRNA和PIM3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

轉(zhuǎn)染后，PIM3-siRNA組細(xì)胞

PIM3

mRNA和PIM3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯低于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表2）

表2 3組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞PIM3 mRNA和PIM3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.2 干擾PIM3的表達(dá)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖能力的影響

轉(zhuǎn)染24、48、72 h后，PIM3-siRNA組細(xì)胞的增殖抑制率均明顯高于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達(dá)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖相關(guān)基因

Ki-67

表達(dá)影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細(xì)胞

Ki-67

mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表3、表4）

表3 轉(zhuǎn)染不同時(shí)間3組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖抑制率的比較（%，±s）

表4 3組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞增殖相關(guān)基因Ki-67 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.3 干擾PIM3的表達(dá)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡能力的影響

轉(zhuǎn)染后，PIM3-siRNA組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的凋亡率為（50.77±2.81）%，明顯高于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組細(xì)胞的（2.33±0.12）%和（2.17±0.09）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達(dá)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因

Bcl-2

、

BAX

、

caspase 3

表達(dá)影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細(xì)胞

Bcl-2

mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，

BAX

、

caspase 3

mRNA的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。干擾

PIM3

的表達(dá)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3表達(dá)影響的結(jié)果顯示，PIM3-siRNA組細(xì)胞Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，BAX、caspase 3蛋白的相對(duì)表達(dá)量均明顯高于溶劑對(duì)照組和scramble-siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表5、表6）

表5 3組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bcl-2、BAX、caspase 3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

表6 3組人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（±s）

2.4 干擾PIM3的表達(dá)對(duì)荷瘤小鼠人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的影響

實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積均明顯低于control組和陰性對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.01）。（表7）

表7 3組荷瘤小鼠腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積的比較（±s）

3 討論

隨著分子生物學(xué)在腫瘤領(lǐng)域的發(fā)展，研究者開始從分子水平探討胰腺癌治療的新靶點(diǎn)，原癌基因也由此成為臨床關(guān)注和研究的重點(diǎn)。目前，腫瘤本身在胰腺癌發(fā)病中具有始動(dòng)作用，可使某些促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的分子異常，如PIM3?；蛎庖咧委熞殉蔀橹委熞认侔┯袘?yīng)用前景的可行策略，引起研究人員的廣泛關(guān)注。目前，研究者經(jīng)常采用siRNA技術(shù)抑制小分子基因片段，即靶向抑制目的基因的表達(dá)，其主要機(jī)制是雙鏈RNA被其特異核酸酶酶切降解，產(chǎn)生發(fā)揮作用的siRNA，這些siRNA通過(guò)與同源的靶序列互補(bǔ)結(jié)合而特異性降解目的片段，最終抑制目的基因的表達(dá)。該技術(shù)需要表達(dá)的元件較少且片斷較小，利于導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，操作簡(jiǎn)單。

有研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用特異性靶向

PIM3

的siRNA能明顯抑制人肝癌細(xì)胞系HepG2和Hep3B在體外的增殖，并顯著誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡；這種現(xiàn)象也發(fā)生在胰腺癌細(xì)胞中，若采用短發(fā)卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）去干擾胰腺癌細(xì)胞系PANC.1和PCI35中PIM3的表達(dá)，細(xì)胞的增殖也會(huì)受到明顯抑制，細(xì)胞凋亡率也會(huì)明顯上升。但應(yīng)用siRNA技術(shù)對(duì)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的生物學(xué)影響還未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，

PIM3

siRNA可以明顯抑制人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的增殖，

PIM3

siRNA轉(zhuǎn)染至人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞后，

Ki-67

mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯降低，表明人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的增殖可以被

PIM3

siRNA抑制。本研究結(jié)果顯示，干擾PIM3的表達(dá)后，人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的凋亡率明顯升高，與既往研究結(jié)果一致。目前，學(xué)者們對(duì)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象進(jìn)行了廣泛、深入的研究，但凋亡的分子和生化機(jī)制仍未徹底明了，已經(jīng)形成的初步認(rèn)識(shí)多源于對(duì)

Bcl-2

基因家族的研究。有報(bào)道指出，Bcl-2是細(xì)胞存活的促進(jìn)因子，屬于膜整合蛋白，可保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受DNA損傷誘導(dǎo)的凋亡作用，Bcl-2還可與促凋亡因子BAX形成二聚體，若BAX的表達(dá)水平高于Bcl-2，BAX同二聚體的數(shù)量就會(huì)增多，從而促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。在凋亡通路中，caspase 3發(fā)揮著不可替代的作用，正常情況下，caspase 3以caspase 3酶原形式存在，且caspase 3酶原并沒(méi)有活性。當(dāng)受到機(jī)體內(nèi)部或外界刺激時(shí)，caspase 3酶原被激活，裂解為活性體，激活凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提示caspase 3是凋亡通路的關(guān)鍵執(zhí)行者。本研究對(duì)

PIM3

siRNA促進(jìn)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞凋亡的機(jī)制進(jìn)行了探討，結(jié)果表明，干擾

PIM3

的表達(dá)后，Bcl-2的表達(dá)受到抑制，BAX、caspase 3的表達(dá)被上調(diào)，最終促進(jìn)了人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的凋亡。

本研究結(jié)果顯示，干擾PIM3的表達(dá)可抑制人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞在荷瘤小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)，這可能與PIM3 siRNA干擾PIM3的表達(dá)，從而直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為PIM3 siRNA對(duì)胰腺癌的抗腫瘤活性研究提供了科學(xué)依據(jù)，是臨床藥物研發(fā)的基礎(chǔ)研究。未來(lái)將進(jìn)一步探討PIM3 siRNA對(duì)其他胰腺癌細(xì)胞的作用，為PIM3 siRNA在胰腺癌治療方面提供更多的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

綜上所述，PIM3 siRNA可通過(guò)干擾PIM3的表達(dá)，誘導(dǎo)人胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的凋亡，在體內(nèi)體外均可抑制胰腺癌AsPC-1細(xì)胞的生長(zhǎng)。