龔龍，易春華，周明，鄭建偉

（1.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院，湖北 荊州 434020；2.華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院，湖北 武漢 430030）

乳頭狀甲狀腺癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）是最常見的甲狀腺癌，腫瘤細胞分化程度和有無淋巴結轉移是PTC預后的重要因素[1-2]。腫瘤微環(huán)境是腫瘤生長和轉移的重要影響因素，而缺氧是眾多實體腫瘤微環(huán)境的顯著特點[3]。本研究采用免疫組織化學法檢測PTC組織及其癌旁組織中缺氧誘導因 子 1a（hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF1a） 和高遷移率族蛋白 1（high mobility group box-1 protein,HMGB1）表達情況，分析HIF-1α和HMGB1與PTC臨床病理特征的關系，旨在為進一步研究HMGB1和缺氧在PTC細胞發(fā)生、發(fā)展過程中的作用和機制提供臨床證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2008年1月—2017年10月經(jīng)華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬荊州醫(yī)院甲狀腺外科術后確診的120例患者的癌組織及相應癌旁組織石蠟標本，所有標本經(jīng)HE染色證實為PTC。其中，男性36例，女性84例;年齡31～76歲，平均46.9歲?；颊咝g前均未行放化療，統(tǒng)計淋巴結轉移及甲狀腺癌臨床分期情況。其中,有淋巴結轉移38例，無淋巴結轉移82例。按照國際抗癌協(xié)會聯(lián)盟的TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期77例，Ⅲ、Ⅳ期43例。

1.2 試劑

兔抗人HMGB1及HIF-1α多克隆抗體購自英國ABCAM公司，兔SP免疫組織化學試劑盒[北京中杉金橋生物技術有限公司（SP-9001）]，DAB顯示劑（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 免疫組織化學

切取石蠟切片，每張切片厚約5μm，采用SP法檢測PTC組織及相應癌旁組織中HIF-1α、HMGB1蛋白的表達（HIF1a一抗工作濃度為1∶100；HMGB1一抗工作濃度為1∶100）。所有操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，以PBS替代一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片作為陽性對照。

1.4 結果判定

根據(jù)REMMELE等[4]提出的免疫反應評分（immunoreactive score, IRS）進行染色反應的評價：IRS=染色強度×陽性細胞百分率。染色強度0為陰性，1為弱，2為中度，3為強。陽性細胞百分率0%為陰性，＞0%～10%為1；＞10%～50%為2；＞50%～80%為3；＞80%為4。IRS評分0～12分，評分＞4分定義為蛋白陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗；變量之間的相互關系采用Spearman相關分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α和HMGB1蛋白在PTC及其癌旁組織中的表達

免疫組織化學染色顯示，PTC組織中，HMGB1陽性呈棕色或褐色，主要定位于細胞核和細胞質(zhì)（見附圖A）。而癌旁組織中，HMGB1主要表達于細胞核中，表達較PTC組織減少，且染色減弱（見附圖B）。同樣地，PTC組織中HIF1a陽性呈棕色或褐色顆粒，主要定位于細胞核和細胞質(zhì)（見附圖C）。而癌旁組織中，HIF1a主要表達于細胞核中，表達較PTC組織減少，且染色減弱（見附圖D）。

附圖 HMGB1、HIF1a在PTC及其癌旁組織中的表達 （SP法×200）

2.2 PTC組織中HMGB1與HIF1a表達的相關性

HMGB1在PTC組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為65.0%和35.0%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.067，P=0.005），PTC組織陽性表達率高于癌旁組織；HIF1a在PTC組織及癌旁組織中的陽性表達率分別為59.2%和40.8%，經(jīng)χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.630，P=0.002），PTC組織陽性表達率高于癌旁組織。相關性分析顯示，PTC組織標本中HMGB1與HIF1a的表達呈正相關（P＜0.05）。見表1。

2.3 PTC組織中HMGB1、HIF1a表達水平與臨床病理特征的關系

HIF1a和HMGB1在不同腫瘤直徑、腫瘤數(shù)量、淋巴結轉移情況及臨床分期方面比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表1 PTC組織中HMGB1與HIF1a表達的相關性 例

表2 PTC組織中HMGB1、HIF1a表達水平與臨床病理特征的關系 例

3 討論

組織缺氧是多數(shù)實體腫瘤常見的病理生理特征，越來越多人認識到其在腫瘤進展的不同階段中起關鍵作用[5]。腫瘤對缺氧的適應主要受缺氧誘導因子（HIF-1α和HIF-2α）的調(diào)節(jié)，HIF-1α與腫瘤啟動子有關，被認為是一個促腫瘤因子，而HIF-2α則被證實是腫瘤抑制基因[6]。迄今為止，已有多項研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在卵巢、食管、頭頸部、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌及口腔上皮等腫瘤中過表達[7-11]。此外，最近一些研究檢測了甲狀腺癌組織中HIF-1α的表達[12-13]。然而，HIF-1α與炎癥效應因子在PTC的發(fā)生、發(fā)展中的關系研究甚少，其相關機制有待進一步研究。

HMGB1蛋白是一種豐富的非組蛋白染色體結合蛋白。其能穩(wěn)定核小體結構并參與DNA的復制、轉錄及修飾[11]。在非惡性細胞中，HMGB1主要存在于細胞核內(nèi)。在腫瘤細胞中，HMGB1表達增多，且可轉位至細胞質(zhì)和細胞外空間中[14]。HMGB1參與炎癥因子的表達和釋放，以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，而HIF-1α可能是HMGB1表達及細胞亞定位的重要調(diào)節(jié)因子[15]。QIU等[16]發(fā)現(xiàn)缺氧誘導HMGB1表達，進而通過ERK/JNK信號通路調(diào)控成骨細胞上皮間質(zhì)轉化。CHENG等[17]還發(fā)現(xiàn)缺氧誘導HMGB1轉為的釋放，進而通過TLRs促進促炎細胞因子產(chǎn)生。而PTC中缺氧與HMGB1的相互表達及作用方式還未見報道。

在本研究中，筆者通過免疫組織化學法檢測HIF-1α、HMGB1在PTC及癌旁組織中的表達，發(fā)現(xiàn)這兩者在PTC中表達升高，主要定位于細胞核和細胞質(zhì)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1和HIF1a在PTC組織中的表達與腫瘤直徑、腫瘤個數(shù)、淋巴轉移及臨床分期有關。提示兩者可能參與PTC發(fā)生、發(fā)展過程。通過相關性分析顯示，PTC組織標本中HMGB1與HIF1a的表達呈正相關，提示HIF1a可能調(diào)控PTC細胞中HMGB1的表達，進而參與PTC的惡性過程。

盡管筆者在PTC臨床樣本中研究了HIF-1α與HMGB1的表達及其相關性，但還需要更多的細胞學實驗來深入研究兩者的調(diào)節(jié)機制及可能的信號通路。同時進一步研究兩者如何參與PTC的發(fā)生、發(fā)展，如腫瘤的增殖、血管生成、遷移及轉移等，以期為以HMGB1為PTC診斷及治療的分子靶點提供更進一步的理論基礎。