吳保慶，張巧梅，黃蘭秀，陳振威，曹遠東，周 志

(1.海大畜牧水產(chǎn)研究中心，廣東廣州511490；2.廣州和生堂動物藥業(yè)有限公司，廣東廣州510550；3.江西嘉博生物工程有限公司，江西九江332600)

近年來，隨著抗生素禁令的逐步實施，人們對獸用抗生素濫用的危害也愈加警覺，在此背景下，中獸藥制劑逐漸成為研究熱點。復方抗病毒口服液，由連翹、金銀花、黃芩、梔子、桔梗、甘草六味中藥制成。六味藥根據(jù)中醫(yī)中藥的遣藥組方原則，按照君、臣、佐、使進行配伍，具有清熱解毒的功效，主治外感發(fā)熱，在臨床上可用于畜禽多種病毒病的防治。胡克杰等[1]通過實驗表明，連翹脂苷對合胞病毒有抑制作用，有效抑制濃度為0.39 mg/mL。段林建等[2]研究表明，連翹苷抗病毒作用是通過抑制甲型流感病毒核蛋白轉(zhuǎn)染后的表達來實現(xiàn)的。Li等[3]研究表明連翹酯苷A對雞傳染性支氣管炎病毒具有體外抑制作用。馬元元等[4]研究表明，連翹苷對圓環(huán)病毒的抑制呈濃度依賴性。金銀花與連翹同為君藥，其中的有機酸對病毒具有一定的抑制作用[5-7]。

研究采用正交法優(yōu)化復方抗病毒口服液的提取工藝，通過HPLC法測定復方抗病毒口服液中連翹苷和綠原酸的含量，優(yōu)選出復方抗病毒口服液的最佳提取工藝，為臨床生產(chǎn)提供一定的理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent-1260 II高效液相色譜儀、AL-204電子天平、0.22 μm濾器。

1.2 材料 連翹300 g、金銀花150 g、黃芩150 g、梔子100 g、桔梗50 g、甘草50 g，購自河北全泰藥業(yè)有限公司(批號：20200513)。

連翹苷(批號：110821-201112)，購自中國食品藥品檢定研究院，綠原酸(批號：110753-202018)，購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方 法

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取時間的考察 稱取藥材5份粉碎，加入10倍量的水量浸泡1 h，提取溫度控制在80 ℃，提取2次，每次提取時間為0.5、1、1.5、2、2.5 h，合并兩次濾液，放置在60 ℃減壓干燥箱中濃縮成相對密度為1.05的浸膏，以連翹苷、綠原酸含量和干膏得率為考察指標，考察提取時間對提取工藝的影響。

2.1.2 提取次數(shù)的考察 稱取藥材5份粉碎，加入10倍的水量浸泡1 h，提取溫度控制在80 ℃，每次提取1 h，提取次數(shù)為1、2、3、4、5次，合并濾液，放置在60 ℃減壓干燥箱中濃縮成相對密度為1.05的浸膏，以連翹苷、綠原酸含量和干膏得率為考察指標，考察提取次數(shù)對提取工藝的影響。

2.1.3 料液比的考察 稱取藥材5份粉碎，分別加入5倍、8倍、10倍、15倍、20倍水量浸泡1 h，提取溫度控制在80 ℃，提取2次，每次1 h，合并濾液，放置在60 ℃減壓干燥箱中濃縮成相對密度為1.05的浸膏，以連翹苷、綠原酸含量和干膏得率為考察指標，考察加水量對提取工藝的影響。

2.2 正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取時間、提取次數(shù)、料液比三個因素，進行三因素三水平L9(33)的正交試驗，試驗設計表見表1。

表1 L9(33)正交試驗設計表

為了更加準確地評估藥效，采用加權(quán)評分法將各主要因素綜合評分。根據(jù)主次關系，人為的將連翹苷含量權(quán)重系數(shù)設置為0.4，綠原酸含量權(quán)重系數(shù)設置為0.4，干膏得率權(quán)重系數(shù)設置為0.2。

綜合評分 = (連翹苷含量 / 最大連翹苷含量)×100×0.4 +(綠原酸含量 / 最大綠原酸含量)×100×0.4 +(干膏得率 / 最大干膏得率)×100×0.2。

2.3 含量檢測

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Wonda SiLTMC18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流速為1 mL/min，進樣量為10 μL，柱溫為25 ℃。連翹苷含量檢測：以乙腈-水(25∶75)為流動相，檢測波長為278 nm；綠原酸含量檢測：以甲醇-水-冰醋酸(20∶80∶1)為流動相，檢測波長為324 nm。

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 對照品溶液 精密稱定連翹苷對照品適量，加50%甲醇制成60 μg/mL的連翹苷對照品溶液；精密稱定綠原酸對照品適量，加水制成40 μg/mL的綠原酸對照品溶液。

2.3.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL，加在中性氧化鋁柱上，用70%乙醇40 mL洗脫，收集洗脫液，濃縮至干，殘渣加50%甲醇適量，溫熱使溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，即得連翹供試品；精密量取本品2 mL，置100 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得金銀花供試品。

2.3.3 標準曲線 將配制的連翹苷對照品溶液，用50%甲醇依次稀釋成10、5、2.5、1.25、0.625 μg/mL的標準溶液；將配制的綠原酸對照品溶液，用水依次稀釋成20、10、5、2.5、1.25 μg/mL的標準溶液，按照上述色譜條件進行檢測，以標準液濃度為橫坐標，以吸收峰面積為縱坐標，建立標準曲線，得線性回歸方程和相關系數(shù)。

2.4 統(tǒng)計分析 運用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行正交統(tǒng)計分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗

3.1.1 提取時間的考察 由表2可見，隨著提取時間的增加，連翹苷含量、綠原酸含量和干膏得率先增加后降低，所以確定正交試驗的提取時間為1、1.5、2 h。

表2 提取時間的考察

3.1.2 提取次數(shù)的考察 由表3可見，隨著提取時間的增加，連翹苷的含量、綠原酸的含量先增加后降低，干膏得率先升高后趨于平穩(wěn)，綜合分析，確定正交試驗的提取次數(shù)為2次、3次、4次。

表3 提取次數(shù)的考察

3.1.3 料液比的考察 由表4可見，連翹苷含量、綠原酸含量和干膏得率在料液比為1∶8、1∶10、1∶15時都比較高，確定正交試驗的料液比為1∶8、1∶10、1∶15。

表4 料液比的考察

3.2 正交試驗 由表5可見，三種因素對提取工藝的影響順序為B(提取次數(shù))>C(料液比)>A(提取時間)，表6方差分析看出，三個因素均無顯著性差異，綜合方差分析與極差分析，確定最佳工藝為A1B1C1，即提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次，料液比為1∶8。

表5 正交試驗結(jié)果

表6 方差分析

3.3 標準曲線 由表7可見，以對照品濃度為橫坐標，吸收峰面積為縱坐標建立的標準曲線，線性回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍。

表7 對照品的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍

4 討論與結(jié)論

連翹、金銀花為君藥，連翹的主要生物活性成分有連翹苷、連翹酯苷、揮發(fā)油等，連翹善走上焦以瀉心火，破血結(jié)，消癰腫。金銀花，既能清氣分之熱，又能解血分之毒，兩藥合用，并走于上，升浮宣散，清氣涼血、清熱解毒，可用于外感風熱，瘡癰腫毒，咽喉腫痛。通過單因素試驗將對提取工藝有影響的因素進行考察，由于連翹苷與綠原酸對溫度都比較敏感，溫度過高會破壞連翹苷的結(jié)構(gòu)，使其變性[8]，升溫可以破壞金銀花的成分，使綠原酸更好的溶出，綠原酸本身不穩(wěn)定，過高的溫度，會使其內(nèi)部基團發(fā)生反應，綠原酸濃度下降[9]，故將提取溫度固定在80 ℃。對提取時間的考察，結(jié)果顯示隨著提取時間的增加連翹苷含量、綠原酸含量均為先升高后降低，這可能是由于隨著提取時間的增加，有效成分逐漸溶出，當有效成分基本溶出完全時，提取時間的增加會導致有效成分的降解。對提取次數(shù)的考察，隨著提取次數(shù)的增加連翹苷含量、綠原酸含量先增加后降低，可能是由于前幾次的提取已經(jīng)將有效成分提出，過多的提取不會再有有效成分的溶出[10]。對料液比的考察，隨著料液比的增加，會增大藥物與溶劑的接觸面積，利于有效成分的溶出[11]，但是過大的料液比會增加能源成本。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果設計正交試驗，以連翹苷含量、綠原酸含量和干膏得率為考察指標，采用加權(quán)法對各因素進行綜合評分，使結(jié)果更加客觀、準確。

研究表明，復方抗病毒口服液提取溫度控制在80 ℃，提取時間為1 h，提取次數(shù)為2次，料液比為1∶8時，綜合評分最高，作為優(yōu)選提取工藝。