吳俊麗，劉 芳，毛志蓉，高小青，杜 杰

0 引 言

慢性傷口常因組織氧合異常而導(dǎo)致傷口長期停滯于炎癥期，從而延遲傷口愈合[1]，并且其發(fā)病率隨著年齡和糖尿病的增加而呈上升趨勢[2]，因而促進(jìn)傷口愈合是亟需解決的問題。傷口愈合過程中，中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在損傷部位浸潤，釋放炎癥細(xì)胞因子、趨化因子和活性氧(reactive oxygen species，ROS)等，這些促炎細(xì)胞通過吞噬和產(chǎn)生自由基清除碎片和殺死細(xì)菌[3-4]。生理水平的ROS也可以促進(jìn)血管收縮、血栓形成和減少局部血流，因而對傷口愈合有重要意義[5]。但是過度的炎癥和ROS產(chǎn)生過量都會延遲傷口愈合。因為過度的炎癥會導(dǎo)致持續(xù)水腫，阻礙傷口愈合的下一步進(jìn)展，而且促炎癥細(xì)胞因子和有毒的自由基對皮膚結(jié)構(gòu)也會造成傷害[6]，而過量的ROS或ROS解毒受損則會導(dǎo)致氧化損傷，是慢性傷口無法愈合的主要原因[5]。

核轉(zhuǎn)錄因子類紅細(xì)胞-2因子(nuclear factor erythoid-2 related factor 2，Nrf2)是抗氧化應(yīng)激防御的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[7]。Nrf2的過表達(dá)可以限制氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。皮膚損傷時，Nrf2表達(dá)上調(diào)[8]。Nrf2在傷口愈合過程中的主要功能是防止內(nèi)源性ROS過度累積[6]。研究表明局部外用三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)可刺激動物皮膚表皮增生，皮膚增厚及毛發(fā)生長[9]，而缺失甲狀腺激素核受體TRα1和TRβ (甲狀腺激素結(jié)合的主要亞型)會導(dǎo)致表皮增殖、毛發(fā)生長和傷口愈合受損[10]。同時，局部外用T3可提高動物皮膚傷口愈合率[11-12]。因而，T3具有促進(jìn)皮膚傷口愈合的能力，但其作用機(jī)制需要深入探討。本研究通過體外制備人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes，HaCaT)氧化應(yīng)激損傷模型，從細(xì)胞毒性、劃痕實驗、Nrf2及下游信號分子表達(dá)，以及炎癥因子參數(shù)變化等方面，探討T3對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料HaCaT細(xì)胞購自湖南豐暉生物科技有限公司。RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Hyclone公司；T3購自上海麥克林生化科技有限公司；MTT購自Sigma；Nrf2抑制劑ML385購自上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司；ROS、IL-6、TNF-α的ELISA試劑盒購自北京安迪華泰科技有限公司；丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)檢測試劑盒試劑盒購自南京建成生物研究所；兔抗Nrf2和HO-1抗體分別購自Cell Signaling Technology和Bioworld Technology、Inc公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，于37 ℃，5% CO2飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)，待HaCaT細(xì)胞密度達(dá)到80%融合度時進(jìn)行傳代。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞增殖活性將HaCaT以5×103個/孔接種在含T3的96孔板，T3濃度為1 nmol/L、0.5 nmol/L和0.1 nmol/L[9]。在分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h后采用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。在各時間點，每孔加入20 μL 0.5% MTT溶液，在37 ℃孵育4 h后再加入150 μL DMSO，于振蕩器上振蕩10 min后，酶標(biāo)儀上490 nm波長處測定各孔吸光度值。

1.2.3H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化損傷模型構(gòu)建及分組取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞，接種于96孔板或6孔板，在含500 μmol/L H2O2的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。將細(xì)胞分為9組：正常組(未進(jìn)行任何干預(yù))、H2O2組(僅用H2O2造模)、ML385組(在用H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞前，先用含20 μmol/L ML385處理細(xì)胞2 h)、1 nmol/LT3組(H2O2誘導(dǎo)2 h后，在含1 nmol/L T3培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h)、0.5nmol/L T3組(H2O2誘導(dǎo)2 h后，在含0.5 nmol/L T3培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h)、0.1 nmol/L T3組(H2O2誘導(dǎo)2 h后，在含0.1 nmol/L T3培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)24 h)、ML385+1 nmol/L T3組(20 μmol/L ML385誘導(dǎo)+1 nmol/L T324h)、ML385+0.5 nmol/L T3組(20 μmol/L ML385誘導(dǎo)+0.5 nmol/L T324h)、ML385+0.1 nmol/L T3組(20 μmol/L ML385誘導(dǎo)+0.1 nmol/L T324h)。每組5個復(fù)孔。

1.2.4MTT法檢測細(xì)胞活性按照2×104個/孔接種于96孔板，分別對9組細(xì)胞采用MTT法檢測細(xì)胞活性。實驗步驟同1.2.2。

1.2.5細(xì)胞劃痕實驗觀察細(xì)胞遷移能力細(xì)胞按照5×105個/孔接種于6孔板，當(dāng)細(xì)胞鋪滿孔底時，按上述9個分組處理細(xì)胞。在T3干預(yù)前用200 μL槍頭垂直孔板劃痕，劃痕后吸去培養(yǎng)液，PBS清洗，各組加入不同濃度T3進(jìn)行干預(yù)，置入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在0 h和20 h時拍照記錄，通過Image J v1.8.0軟件計算細(xì)胞遷移面積，分析各組劃痕面積修復(fù)率。劃痕面積修復(fù)率計算如下：

劃痕面積修復(fù)率=(0 h劃痕面積-20 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%

1.2.6ELISA法和比色法檢測氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)細(xì)胞按照5×105個/孔接種于6孔板，按照9個分組處理細(xì)胞后，收集細(xì)胞上清，通過ELISA法和比色法檢測上清中氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)含量，包括MDA、ROS、GSH、CAT和SOD，以及炎癥因子IL-6和TNF-α含量。具體實驗步驟按照試劑盒說明書操作進(jìn)行，在酶標(biāo)儀上測量各孔吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算相應(yīng)指標(biāo)的測定值。

1.2.7Western blot檢測細(xì)胞Nrf2和HO- 1蛋白表達(dá)收集上清后的各組細(xì)胞加入PMSF/RIPA裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮樣變性。取等質(zhì)量蛋白樣品在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入兔抗Nrf2 (1 ∶ 800)、兔抗HO-1 (1 ∶ 800)，以及兔抗Tubulin (1 ∶ 2000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗 (1 ∶ 800)室溫孵育1 h，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用Image Jv1.8.0軟件分析蛋白條帶灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量計算公式如下：

目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值

2 結(jié) 果

2.1 T3對HaCaT細(xì)胞增殖活性的影響1 nmol/L T3、0.5 nmol/L T3、0.1 nmol/L T3細(xì)胞的增殖活性顯著高于正常細(xì)胞(P<0.05)，表明各濃度的T3均促進(jìn)了細(xì)胞生長。見表1。

表 1 T3對細(xì)胞增殖活性的影響

2.2T3對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響H2O2組和ML385組的細(xì)胞活性顯著低于正常組(P<0.05)；1 nmol/L T3組、0.5 nmol/L T3組和0.1 nmol/L T3組的細(xì)胞活性高于H2O2組(P<0.05)；ML385+1 nmol/L T3組細(xì)胞活性較1nmol/L T3組明顯降低(P<0.05)；ML385+0.5 nmol/L T3組細(xì)胞活性較0.5nmol/L T3組明顯降低(P<0.05)，ML385+0.1 nmol/L T3組細(xì)胞活性較0.1 nmol/L T3組明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.3T3對細(xì)胞遷移能力的影響細(xì)胞劃痕實驗所示，培養(yǎng)20 h，H2O2組和ML385組的面積修復(fù)率顯著低于正常組(P<0.05)；1 nmol/L T3組、0.5 nmol/L T3組和0.1 nmol/L T3組面積修復(fù)率較H2O2組明顯增高(P<0.05)；ML385+1 nmol/L T3組較1 nmol/L T3組、ML385+0.5 nmol/L T3組較0.5 nmol/L T3組、ML385+0.1 nmol/L T3組較與0.1 nmol/L T3組面積修復(fù)率顯著降低(P<0.05)，見圖1，表2。

2.4T3對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和炎癥因子的影響與正常組比較，H2O2組細(xì)胞上清內(nèi)的氧化產(chǎn)物MDA和ROS水平，及炎癥因子IL-6和TNF-α水平升高(P<0.05)，而抗氧化物GSH、CAT和SOD水平降低(P<0.05)。1 nmol/L T3組、0.5 nmol/L T3組和0.1 nmol/L T3組的MDA、ROS、IL-6和TNF-α水平較H2O2組明顯降低(P<0.05)，GSH、CAT和SOD水平明顯升高(P<0.05)。ML385+1 nmol/L T3組較1 nmol/L T3組、ML385+0.5 nmol/L T3組較0.5 nmol/L T3組、ML385+0.1 nmol/L T3組較0.1 nmol/L T3組MDA、ROS、IL-6和TNF-α水平明顯升高(P<0.05)，GSH、CAT和SOD水平明顯降低(P<0. 05)，見表3。

表 2 各組細(xì)胞活性和面積修復(fù)率比較

圖示T3促進(jìn)了HaCaT細(xì)胞遷移，而ML385降低了T3作用

1：正常組；2：H2O2組；3：ML385組；4：1nmol/L T3組；5：0.5nmol/L T3組；6：0.1nmol/L T3組；7：ML385+1nmol/L T3組；8：ML385+0.5nmol/L T3組；9：ML385+0.1nmol/L T3組

圖 1 劃痕實驗檢測各組HaCaT細(xì)胞遷移( ×100)

Figure 1 The representative images of the migration of HaCaT cells detected by scratch wound assay ( ×100)

表 3 各組細(xì)胞上清中氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)指標(biāo)水平比較

2.5T3對Nrf2/HO-1信號通路蛋白的影響H2O2組Nrf2與HO-1的蛋白水平高于正常組(P<0.05)，而ML385組低于正常組(P<0.05)；與H2O2組比較，1nmol/L T3組、0.5 nmol/L T3組、0.1 nmol/L T3組Nrf2與HO-1表達(dá)明顯升高(P<0.05)；ML385+1 nmol/L T3組較1 nmol/L T3組、ML385+0.5 nmol/L T3組較0.5 nmol/L T3組、ML385+0.1 nmol/L T3組較0.1 nmol/L T3組Nrf2與HO-1蛋白的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見圖2，表4。

1：正常組；2：H2O2組；3：ML385組；4：1 nmol/L T3組；5：0.5 nmol/L T3組；6：0.1 nmol/L T3組；7：ML385+1 nmol/L T3組；8：ML385+0.5 nmol/L T3組；9：ML385+0.1 nmol/L T3組

表 4 各組細(xì)胞的Nrf2和HO-1蛋白相對表達(dá)水平比較

3 討 論

傷口愈合是一個復(fù)雜的，高度調(diào)節(jié)的過程，對維持皮膚屏障功能至關(guān)重要。如果伴行多種疾病過程，與傷口愈合有關(guān)的連鎖反應(yīng)可能會受到影響，常導(dǎo)致慢性或無法愈合的傷口，令患者感到嚴(yán)重不適和痛苦，同時消耗大量醫(yī)療系統(tǒng)資源[13]。研究表明T3在傷口愈合中發(fā)揮作用，外用T3治療加速了嚙齒類動物傷口愈合[12, 14]。本實驗應(yīng)用H2O2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞以模擬皮膚傷口氧化損傷，并用T3干預(yù)，結(jié)果顯示T3減輕了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性，提高了劃痕面積修復(fù)率，后者表明T3增強(qiáng)了氧化應(yīng)激下的HaCaT遷徙能力，間接表明T3能促進(jìn)傷口再上皮化。應(yīng)用Nrf2抑制劑ML385干預(yù)后，細(xì)胞活性和面積修復(fù)率又降低。T3促進(jìn)傷口愈合的確切機(jī)制目前仍然不清楚，因而需要進(jìn)一步深入研究。因本實驗發(fā)現(xiàn)T3減輕了H2O2誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞氧化及炎性損傷，因此，T3可能通過抗氧化和抗炎癥反應(yīng)促進(jìn)傷口愈合。

在正常的傷口愈合過程中，作為對入侵病原體的固有反應(yīng)，受損組織會產(chǎn)生ROS作為細(xì)胞信使刺激與傷口愈合相關(guān)的關(guān)鍵過程，包括細(xì)胞運(yùn)動、血管生成和細(xì)胞因子作用等[15-16]。然而，ROS產(chǎn)生過多超過了其有益作用則會導(dǎo)致額外的組織損傷[17]。抗氧化機(jī)制保護(hù)細(xì)胞免受ROS誘導(dǎo)的損傷，但若因各種原因造成氧化平衡被打破，組織將經(jīng)歷氧化應(yīng)激，對包括蛋白質(zhì)、脂類和核酸在內(nèi)的多種分子造成損害[15]。已知的抗氧化系統(tǒng)成員有GSH、CAT、SOD和HO-1和醌氧化還原酶-1(quinine oxidoreductase-1，NQO-1)等，而這些細(xì)胞保護(hù)蛋白均受Nrf2調(diào)控[18-20]。本實驗發(fā)現(xiàn)H2O2會誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞氧化產(chǎn)物MDA和ROS含量增多，而抗氧化物GSH、CAT和SOD含量降低，同時，H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞的Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)升高，表明H2O2誘導(dǎo)了HaCaT氧化損傷，同時也激活了Nrf2通路。當(dāng)用3種濃度T3干預(yù)后，MDA和ROS含量降低，GSH、CAT和SOD含量升高，而Nrf2和HO-1的表達(dá)更強(qiáng)，3個T3組之間的這些指標(biāo)表達(dá)水平?jīng)]有差異，表明T3激活了Nrf2通路并減輕了細(xì)胞氧化損傷，并在0.1～1 nmol/L濃度范圍內(nèi)其作用強(qiáng)度沒有差異。為了進(jìn)一步探討Nrf2信號通路在T3減輕氧化損傷中的作用，本實驗用了Nrf2抑制劑ML385進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)ML385干預(yù)后，ML385+T3與T3相比，其MDA、ROS水平升高，而GSH、CAT、SOD、HO-1和Nrf2水平降低，這些結(jié)果說明Nrf2信號通路參與了T3減輕H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷作用。

傷口愈合炎癥期，受傷部位浸潤的中性粒細(xì)胞除產(chǎn)生ROS外，還通過呼吸爆發(fā)活動釋放炎癥介質(zhì)，如IL-6和TNF-α[21]。持續(xù)的炎癥會損傷修復(fù)部位生長中的組織，導(dǎo)致傷口無法愈合[22-23]。因組織損傷后幾乎會立即引起急性炎癥，因此控制炎癥可以優(yōu)化創(chuàng)傷修復(fù)過程。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個濃度的T3顯著降低了H2O2誘導(dǎo)的的IL-6和TNF-α水平，提示T3減輕了H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性損傷，而3個濃度之間比較沒有顯著差異，表明在0.1～1 nmol/L濃度范圍內(nèi)其抗炎作用強(qiáng)度沒有差異。使用ML385后，IL-6和TNF-α的水平又升高，表明Nrf2信號通路參與了T3的抗炎作用。

綜上所述，本實驗表明了T3減輕了H2O2誘導(dǎo)的氧化及炎性損傷，可能是通過激活Nrf2介導(dǎo)的抗氧化信號通路起作用。對T3的作用機(jī)制的闡明，有利于為T3治療皮膚創(chuàng)傷的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)，并為皮膚創(chuàng)傷的治療提供一種既高效、安全而又成本低廉的候選藥物。