柳 麗，季凱琳，徐海玲，曹夢(mèng)怡，蘇 丹，劉 晶

0 引 言

應(yīng)激是指機(jī)體遭受內(nèi)外環(huán)境改變時(shí)做出的非特異性全身性反應(yīng)，該過(guò)程伴隨著下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的過(guò)度激活及大量應(yīng)激激素的釋放[1]。研究顯示長(zhǎng)期慢性應(yīng)激與多種情緒和認(rèn)知障礙的發(fā)生密切相關(guān)[2-3]。皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)是動(dòng)物體內(nèi)的主要應(yīng)激激素，外源性CORT不僅可以誘發(fā)動(dòng)物的焦慮、抑郁和認(rèn)知障礙行為，更能誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞損傷，其損傷機(jī)制與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡等有關(guān)[4-7]。減輕皮質(zhì)酮對(duì)中樞神經(jīng)元的損傷有望為應(yīng)激引發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的治療途徑。

雷公藤甲素(triptolide，TP)是從衛(wèi)矛科植物雷公藤中提取的三氧化二萜類(lèi)化合物，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[8]。TP是一種高脂溶性的小分子化合物，能夠輕易透過(guò)血腦屏障，預(yù)示其可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有一定的應(yīng)用價(jià)值[9]。近年的研究顯示TP能夠顯著改善阿爾茨海默癥(Alzheimer′s disease，AD)動(dòng)物的認(rèn)知障礙、帕金森病(Parkinson disease，PD)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)障礙、抑郁動(dòng)物的情緒障礙以及神經(jīng)病理性疼痛動(dòng)物的疼痛行為，并能在體外減輕Aβ、脂多糖、α-synuclein等誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷[10-13]。

然而，雷公藤甲素能否減輕CORT引起的神經(jīng)細(xì)胞損傷尚無(wú)報(bào)道，本研究建立CORT誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞損傷模型，旨在考察雷公藤甲素對(duì)CORT誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用并探討其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞由徐州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院饋贈(zèng)。雷公藤甲素、皮質(zhì)酮、LY-294002購(gòu)自sigma公司。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自Gibco公司；MTT檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、Hoechst33258染色試劑盒、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自碧云天公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；AKT、pAKT、CREB、pCREB、BDNF、Bax、Bcl-2、β-actin抗體和相應(yīng)的二抗分別購(gòu)自CST(Cell Signling Technology)和武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)HT-22細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)接種于不同培養(yǎng)板中用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CORT損傷模型的建立和分組給藥根據(jù)我們的前期研究[14]，將HT-22細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后，采用CORT(終濃度為200μmol/L，無(wú)血清培養(yǎng)基)作用于細(xì)胞24h以建立CORT損傷模型。采用DMSO配置濃度為0.01 mol/L的TP母液，用無(wú)血清培養(yǎng)基逐級(jí)稀釋至所需濃度。在考察TP對(duì)CORT損傷細(xì)胞的保護(hù)作用時(shí)設(shè)空白對(duì)照組、CORT損傷組、TP干預(yù)組，在CORT損傷前加入不同濃度TP孵育半小時(shí)。在考察PI3K/AKT抑制劑LY294002(LY)的作用時(shí)，增加TP+LY干預(yù)組，即HT-22細(xì)胞先與LY294002(10 μmol/L)共孵育0.5 h，再進(jìn)行相應(yīng)給藥處理。每組給藥體系內(nèi)的DMSO總含量低于0.1%。

1.2.3MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖將HT-22細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同濃度TP(0.01、0.1、1 nmol/L)處理，24 h后吸棄舊培養(yǎng)液，每孔加入MTT工作液，37 ℃孵育4 h，加入Formanzan溶解液使結(jié)晶物充分溶解后在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)570 nm處的吸光度值。TP預(yù)處理能呈劑量依賴(lài)性地顯著減輕CORT引起的細(xì)胞活力下降和LDH釋放，其中1 nmol/LTP的神經(jīng)保護(hù)作用最強(qiáng)，因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們選用1 nmol/LTP探討其作用機(jī)制。

1.2.4LDH釋放檢測(cè)將HT-22細(xì)胞按5×103個(gè)/孔的密度種于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同藥物處理，24 h后離心分別取各孔的上清液120 μL轉(zhuǎn)移至新的96孔板內(nèi)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度值。

1.2.5生化法檢測(cè)細(xì)胞中SOD、GSH-Px、MDA含量將HT-22細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同藥物處理，24 h后收集細(xì)胞，按試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)SOD、GSH-Px和MDA含量。

1.2.6Hoechst 33258染色將HT-22細(xì)胞按1×106個(gè)/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行不同藥物處理，24 h后棄去原培養(yǎng)液，每孔加入4%多聚甲醛室溫下固定10 min，棄去固定液，PBS洗滌3次后加入Hoechst33258染色液染色5 min，PBS洗滌3次后于熒光顯微鏡下觀察各處理組細(xì)胞核染色情況并拍照、計(jì)數(shù)。

1.2.7Western blot法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平收集各組細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30～50 μg蛋白上樣，10% SDS-PAGE進(jìn)行蛋白分離后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5% BSA室溫封閉處理2 h，隨后孵育稀釋的AKT、pAKT、CREB、p-CREB、BDNF、Bax、Bcl-2、β-actin抗體4 ℃反應(yīng)過(guò)夜，次日TBST洗膜3次后，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后顯影，通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié) 果

2.1 TP對(duì)CORT誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響與空白對(duì)照組相比，CORT損傷組SOD和GSH-Px活性水平明顯降低(P<0.05)，MDA含量顯著升高(P<0.01)；與CORT損傷組相比，TP干預(yù)能顯著升高細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性(P<0.05)、降低MDA水平(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表 1 TP對(duì)CORT誘導(dǎo)HT-22細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.2TP對(duì)CORT誘導(dǎo)HT-22細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33258染色結(jié)果顯示，對(duì)照組HT-22的細(xì)胞核被染成均一的淡藍(lán)色，與之相比CORT損傷后細(xì)胞核被染成亮藍(lán)色，并伴有細(xì)胞核固縮、碎裂、染色質(zhì)凝結(jié)等現(xiàn)象；而TP干預(yù)組的細(xì)胞核形態(tài)及染色情況均得到了顯著改善。見(jiàn)圖1。同時(shí)，與對(duì)照組相比，CORT組細(xì)胞凋亡率顯著增加、Bcl-2/Bax比率顯著降低(P<0.01)，而TP預(yù)處理能明顯減少細(xì)胞凋亡、提高Bcl-2/Bax比率(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

2.3TP對(duì)CORT誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞中AKT、CREB、BDNF蛋白表達(dá)的影響與對(duì)照組相比，CORT損傷組AKT、CREB的磷酸化水平及BDNF的表達(dá)均明顯降低，而TP干預(yù)顯著促進(jìn)了pAKT、pCREB和BDNF的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

a:空白對(duì)照組; b:CORT損傷組; c:TP干預(yù)組; d:各組HT-22細(xì)胞凋亡率比較

1:空白對(duì)照組; 2:CORT損傷組; 3:TP干預(yù)組

1:空白對(duì)照組; 2:CORT損傷組; 3:TP干預(yù)組

2.4PI3K/AKT抑制劑LY294002對(duì)TP神經(jīng)保護(hù)作用的影響與空白對(duì)照組比較，CORT損傷組細(xì)胞活力下降而LDH釋放量增加(P<0.01)；與CORT損傷組比較，TP干預(yù)組細(xì)胞活力升高(P<0.01)，而LDH釋放量降低(P<0.01)；與TP干預(yù)組比較，TP+LY干預(yù)組細(xì)胞活力降低(P<0.01)，而LDH釋放量升高(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表 2 LY 294002對(duì)TP神經(jīng)保護(hù)作用的影響

3 討 論

海馬神經(jīng)元受損是長(zhǎng)期慢性應(yīng)激引發(fā)神經(jīng)精神類(lèi)疾病的主要病理機(jī)制之一。CORT是嚙齒類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)的主要應(yīng)激激素，海馬神經(jīng)元細(xì)胞持續(xù)暴露于高水平CORT將會(huì)抑制神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究采用高濃度CORT作用于小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞構(gòu)建體外應(yīng)激模型，以探討TP對(duì)CORT損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，極低劑量的TP可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受CORT的損傷。該結(jié)果可能解釋了TP在小鼠慢性不可預(yù)知應(yīng)激模型中的抗抑郁作用[15]。

由于神經(jīng)系統(tǒng)具有代謝率高以及抗氧化防御能力弱的特點(diǎn)，氧化應(yīng)激極易對(duì)其造成損傷。體內(nèi)外研究均顯示，應(yīng)激激素對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷與大量氧自由基的產(chǎn)生密切相關(guān)[16-17]。氧自由基不僅能引起神經(jīng)細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，還會(huì)導(dǎo)致大量鈣離子內(nèi)流，細(xì)胞骨架受損，最終導(dǎo)致海馬神經(jīng)元的死亡。提高神經(jīng)細(xì)胞的抗氧化能力可以保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損害[18]。TP是具有極強(qiáng)抗氧化能力的中藥單體，在Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型中，TP通過(guò)上調(diào)SOD活性，減少細(xì)胞內(nèi)ROS、H2O2和MDA的水平，減輕Aβ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，從而抑制Aβ引發(fā)的細(xì)胞凋亡[19]。本研究中，TP同樣能夠?qū)笴ORT誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，表現(xiàn)為上調(diào)SOD和GSH-Px活性，促進(jìn)MDA清除，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

眾多研究表明，中樞神經(jīng)細(xì)胞凋亡是應(yīng)激誘導(dǎo)認(rèn)知、情緒障礙的主要分子機(jī)制，更是CORT引起神經(jīng)元受損的主要方式[20-22]。磷酸肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase，AKT)信號(hào)是介導(dǎo)神經(jīng)元生長(zhǎng)存活的重要通路，磷酸化的AKT一方面調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2家族等)的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，另一方面激活多個(gè)下游信號(hào)通路蛋白促進(jìn)細(xì)胞存活[21-23]。其中環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element-bindingprotein，CREB)是PI3K/AKT下游的重要信號(hào)分子，磷酸化激活的CREB可進(jìn)一步促進(jìn)腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達(dá)而共同調(diào)控神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、分化成熟[24]。已有研究顯示在CORT引起的神經(jīng)損傷中存在PI3K/AKT信號(hào)的抑制，激活A(yù)KT可以進(jìn)一步調(diào)控下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，繼而逆轉(zhuǎn)CORT誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡[21-22]。本研究中，TP不僅可以減輕CORT導(dǎo)致的pAKT表達(dá)抑制，更能進(jìn)一步促進(jìn)其下游CREB的磷酸化和BDNF的表達(dá)，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax的比值，從而抑制CORT誘導(dǎo)的HT-22細(xì)胞凋亡。且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT抑制劑LY294002能部分消除TP的神經(jīng)保護(hù)作用，再次表明TP對(duì)CORT誘導(dǎo)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用可能與激活PI3K/AKT通路有關(guān)。

綜上所述，TP能減輕CORT誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元損傷，其機(jī)制與抗氧化、抑制凋亡、激活PI3K/AKT通路有關(guān)，這為T(mén)P在應(yīng)激所致中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。但本研究只探討了TP作用于HT-22細(xì)胞24 h后的神經(jīng)保護(hù)作用，鑒于TP的潛在細(xì)胞毒性，TP長(zhǎng)時(shí)間作用的有效性和安全性還需深入考察。