邵 晗，李思源，高 群，李 軍

0 引 言

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種以骨組織微結(jié)構(gòu)受損，骨密度下降為特征的代謝性疾病[1]。目前在中國(guó)老齡人口中，約有830萬OP患者，絕經(jīng)后女性約占其中的1/3[2]。目前研究發(fā)現(xiàn)，影響OP的危險(xiǎn)因素包括雌激素、血糖及血脂水平等[3]；其中有陽性家族史的家庭是臨床患者骨量異常(abnormal bone mass，ABM)的另一個(gè)危險(xiǎn)因素[4]。作為OP的前期階段，及時(shí)給予ABM的患者治療可延緩OP的發(fā)生。由于OP具有很強(qiáng)遺傳性，與之相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)已成為研究熱點(diǎn)。低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(low density lipoprotein receptor related protein 5，LRP5)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白6(low density lipoprotein receptor related protein 6，LRP6)作為Wnt信號(hào)通路的經(jīng)典調(diào)節(jié)因子，Wnt蛋白與Frizzled受體以及LRP5/6輔受體結(jié)合，調(diào)節(jié)下游分子的轉(zhuǎn)錄，影響成骨細(xì)胞，誘導(dǎo)骨重建[5]。既往研究多對(duì)單個(gè)基因單個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)性或突變與OP的關(guān)系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)LRP5/6基因位點(diǎn)不同程度上參與了ABM的發(fā)生；而關(guān)于以上2種基因的交互作用、環(huán)境因素與ABM發(fā)生的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道?；?基因、基因-環(huán)境交互作用，在一定程度上闡明了為何攜帶易感基因的人群中，僅有部分人群患??；暴露于相同的環(huán)境下，也僅有部分人患病。本團(tuán)隊(duì)前期的研究已發(fā)現(xiàn)LRP5基因位點(diǎn)的多態(tài)性與絕經(jīng)后2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)女性患者BMD的降低有關(guān)[6]。為進(jìn)一步探究多種因素的交互作用，本研究擬測(cè)定新疆絕經(jīng)后女性LRP5基因rs41494349、rs2306862位點(diǎn)和LRP6基因rs10743980、rs2302685位點(diǎn)的交互作用與ABM的關(guān)系，以期為預(yù)防OP的發(fā)生提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象納入2018年12月-2019年12月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的272例絕經(jīng)后女性患者。OP按照1994年WHO推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。依據(jù)BMD測(cè)結(jié)果將研究對(duì)象分為對(duì)照組(骨量正常組)、ABM組(骨量異常組=骨量減少+OP)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①自然絕經(jīng)后1年以上女性；②年齡47～80歲；③所有參與者均為漢族，在基因上無任何血緣關(guān)系，病史完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1型糖尿病、自身免疫性疾病、甲狀腺及甲狀旁腺疾病、嚴(yán)重的心、肝、腎疾病及惡性腫瘤對(duì)Ca及其他骨代謝指標(biāo)有影響的基礎(chǔ)疾病等。本研究通過石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(倫理號(hào)：2019-129-01)。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2觀察指標(biāo)收集并分析納入研究對(duì)象的年齡、絕經(jīng)年限、體重指數(shù)(BMI)和腰臀比(WHR)等基線資料；羅氏全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào) Modular DPP-H7600)測(cè)得鈣(Ca)、磷(P)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)；雙能X線骨密度儀(DEXA)測(cè)定骨密度(L1-4、FN)。

1.3LRP5、LRP6基因測(cè)定采用DNA提取試劑盒從患者血液中提取基因組DNA[賽默飛世紀(jì)科技(中國(guó))設(shè)備有限公司]，檢測(cè)DNA的濃度及純度。采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight，MALDI-TOF)進(jìn)行分型檢測(cè)。測(cè)定LRP5、LRP6基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性及基因型分布頻率。各位點(diǎn)引物見表1。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)樣本進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以M(P25，P75)表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)判斷LRP5、LRP6基因是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，以及組間基因型及基因分布頻率。Logistic回歸分析及多因子降維分析基因多態(tài)性與ABM易感性、LRP5、LRP6基因SNP基因-基因、基因-年齡、基因-絕經(jīng)年限間的交互作用，以O(shè)R(95%CI)表示。應(yīng)用多因子降維法，進(jìn)行交叉驗(yàn)證一致性及檢驗(yàn)精確度進(jìn)行驗(yàn)證。所有模型均進(jìn)行置換檢驗(yàn)1000次。所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表 1 各位點(diǎn)引物及PCR產(chǎn)物

2 結(jié) 果

2.1 組間基線資料的比較此次研究共納入272例研究對(duì)象，其中ABM組166例、對(duì)照組106例。與對(duì)照組相比，ABM組的年齡和絕經(jīng)年限較高(P<0.05)，BMD(L1-4、FN)較低(P<0.01)。見表2。

表 2 各組絕經(jīng)后女性患者一般資料的比較

2.2Hardy- Weinberg遺傳平衡及ABM易感性分析在對(duì)照組中進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。LRP5基因rs10743980、rs2306862位點(diǎn)和LRP6 基因rs10743980、rs2302685位點(diǎn)的基因型分布頻率均與遺傳平衡相符(P>0.05)。Logistic回歸分析顯示，LRP5基因rs2306862位點(diǎn)CT 、CT/TT 基因型患ABM的風(fēng)險(xiǎn)高于CC基因型(OR=2.353，95%CI=1.039～6.186；OR=2.434，95%CI=1.071，5.531；P<0.05)；LRP6基因rs2302685位點(diǎn)TC基因型患ABM的風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型(OR=2.951，95%CI=1.030～8.457，P<0.05)。余各SNP位點(diǎn)未見明顯異常(P>0.05)。見表3。

表 3 LRP5、LRP6基因位點(diǎn)基因型與ABM易感性的二元Logistic回歸分析[n(%)]

2.3LRP5、LRP6基因位點(diǎn)交互作用以是否有ABM為因變量，以4個(gè)SNP位點(diǎn)作為自變量(0=無風(fēng)險(xiǎn)等位基因，1=1個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因，2=2個(gè)風(fēng)險(xiǎn)等位基因)。在2位點(diǎn)中，rs2306862&rs10743980基因位點(diǎn)的多態(tài)性與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，是ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素(OR=1.462，95%CI：1.128～1.895，P<0.05)； 在3位點(diǎn)中，rs41494349&rs2302685&rs10743980基因多態(tài)性與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素(OR=1.504，95%CI：1.092～2.073，P<0.05)。其余位點(diǎn)基因多態(tài)性與ABM的發(fā)生均未見明顯的交互作用(P>0.05)。見表4。

2.4LRP5、LRP6基因位點(diǎn)-年齡、絕經(jīng)年限間的交互作用

2.4.1LRP5、LRP6基因位點(diǎn)-年齡間的交互作用在以上有交互作用的位點(diǎn)中，調(diào)整絕經(jīng)年限的協(xié)變量。在1位點(diǎn)中，rs2306862、rs2302685位點(diǎn)的多態(tài)性&年齡與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，是ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素(OR=1.010，95%CI：1.003～1.017，P<0.05)；OR=1.016，95%CI：1.004～1.028，P<0.05)。在3位點(diǎn)中，rs41494349&rs2302685&rs10743980位點(diǎn)多態(tài)性&年齡與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素(OR=1.005，95%CI：1.002～1.008，P<0.05)。其余位點(diǎn)基因多態(tài)性&年齡與ABM的發(fā)生均未見明顯的交互作用(P>0.05)。見表5。

2.4.2LRP5、LRP6基因位點(diǎn)-絕經(jīng)年限間的交互作用在以上有交互作用的位點(diǎn)中，調(diào)整年齡的協(xié)變量。均未發(fā)現(xiàn)各位點(diǎn)基因多態(tài)性&絕經(jīng)年限與ABM的發(fā)生存在交互作用(P>0.05)。見表6。

表 4 LRP5、LRP6基因位點(diǎn)間的交互作用

表 5 LRP5、LRP6基因位點(diǎn)-年齡間的交互作用

表 6 LRP5、LRP6基因位點(diǎn)-絕經(jīng)年限間的交互作用

3 討 論

OP是以BMD降低為主要表現(xiàn)，嚴(yán)重威脅居民健康的一種慢性代謝性疾病，OP后骨折的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[8]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，尤其是近年來人們?cè)絹碓疥P(guān)注精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)，基因多態(tài)性與OP的發(fā)生密切相關(guān)。因其對(duì)OP的發(fā)生、發(fā)展和不同治療手段的反應(yīng)明顯，故尋找與OP發(fā)生發(fā)展相關(guān)的多態(tài)性基因位點(diǎn)具有重要意義[9]。60%～80%的BMD變異性由遺傳因素決定；但對(duì)于OP高峰期的遺傳影響尚不明確[9]。補(bǔ)充鈣劑僅能短暫增加BMD水平，緩解患者的骨痛癥狀，但無法從根本上改善患者的疾病狀態(tài)，且藥物治療后骨量的流失依然會(huì)繼續(xù)進(jìn)展[9]。目前對(duì)于LRP5/6基因的研究有望于精準(zhǔn)化治療，從根本上改善預(yù)后。

LRP5/6是組成Wnt/β-catenin信號(hào)通路的跨膜受體蛋白，其編碼的蛋白屬于Wnt配體的共同受體[13]。LRP5/6受體蛋白與下游β-catenin結(jié)合，促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。LRP5/6基因突變會(huì)導(dǎo)致Wnt信號(hào)通路失去對(duì)細(xì)胞的調(diào)控作用[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，LRP5基因rs2306862位點(diǎn)CT 、CT/TT 基因型患ABM的風(fēng)險(xiǎn)高于CC基因型，說明突變的等位基因T與ABM的易感性相關(guān)；LRP6基因rs2302685位點(diǎn)TC基因型患ABM的風(fēng)險(xiǎn)高于TT基因型，同樣突變的等位基因C也可增加ABM的風(fēng)險(xiǎn)。AI等[15]的研究成果發(fā)現(xiàn)，罕見的功能缺失的LRP5突變導(dǎo)致OP，LRP5基因突變能夠促進(jìn)DKK1競(jìng)爭(zhēng)性的與LRP5/6 受體結(jié)合，從而阻止Wnt/β-catenin 信號(hào)的傳導(dǎo)。其研究結(jié)論與本研究一致。Ligdle等[16]研究了成骨細(xì)胞中LRP5和LRP6的缺失，刪除成骨細(xì)胞中的LRP6可降低小梁室中骨纖維結(jié)構(gòu)的形成。在Riancho等[17]對(duì)歐洲地區(qū)絕經(jīng)后女性LRP6基因rs2302685及rs11054704位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性參與了BMD的降低。而Nima等[18]的研究同樣發(fā)現(xiàn)LRP6基因rs2302685位點(diǎn)CC基因型個(gè)體的粗隆間骨密度明顯高于TT/CT基因型個(gè)體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)，LRP5/6是功能重疊的同源性受體，在小鼠的胚胎發(fā)育中，這2種蛋白都通過Wnt信號(hào)刺激出生后的骨獲取[10-11]，LRP6-/-小鼠出生時(shí)會(huì)因中軸骨骼和肢體缺損而死亡，而成年LRP5-/-小鼠導(dǎo)致OP[12]。以上研究結(jié)果與本研究結(jié)果相一致。

復(fù)雜疾病的發(fā)生多由遺傳和環(huán)境因素共同決定，其中存在基因-基因的交互作用，暗示了其致病效應(yīng)上的協(xié)同性。這種協(xié)同性表現(xiàn)在易感人群中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)性。本研究探究LRP5/6基因各位點(diǎn)的交互作用發(fā)現(xiàn)rs2306862&rs10743980、rs41494349&rs2302685&rs10743980基因位點(diǎn)的多態(tài)性與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，是ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，同時(shí)攜帶LRP5和LRP6雜合突變的小鼠可以降低BMD，導(dǎo)致肢體畸形[19]。這表明LRP5和LRP6在肢體發(fā)育和BMD獲得過程中存在相互作用。LRP5和LRP6突變體在24周時(shí)皮質(zhì)骨面積、皮質(zhì)厚度和極性慣性矩均降低。這兩個(gè)輔助受體的缺失導(dǎo)致了患有OP表型的小鼠的早期死亡[20]。Van Meurs等[21]同樣研究發(fā)現(xiàn)LRP5、LRP6基因共同在骨代謝和骨折發(fā)揮作用。以上數(shù)據(jù)表明，OP的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)可能會(huì)因基因多態(tài)性而改變，且其對(duì)OP的易感性相互作用。疾病的發(fā)生同樣也需要環(huán)境因素的參與，其表現(xiàn)為基因-環(huán)境之間的交互作用，rs2306862、rs2302685、rs41494349&rs2302685&rs10743980位點(diǎn)的多態(tài)性&年齡與ABM的發(fā)生存在協(xié)同作用，是ABM發(fā)生的危險(xiǎn)性因素。年齡作為OP發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素已得到公認(rèn)，隨著年齡的增加，OP的患病率逐年遞增。但本研究未得到ABM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)與絕經(jīng)年限之間的關(guān)系，其原因可能：①女性在絕經(jīng)后雌激素水平明顯下降，早期可引起B(yǎng)MD代償性的升高，從而掩蓋了基因交互作用對(duì)其的影響。②OP是一個(gè)基因及環(huán)境多重因素相互作用的疾病，在激活Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)的同時(shí)，也會(huì)應(yīng)激性激活OPG/RANK/RANKL相關(guān)的成骨細(xì)胞通路，通過代償性刺激成骨細(xì)胞形成，而補(bǔ)充破骨細(xì)胞的凋亡。③本文研究Wnt信號(hào)通路中LRP5/6互相協(xié)同作用的2個(gè)基因不同位點(diǎn)的多態(tài)性對(duì)ABM的影響，明確了LRP5/6基因位點(diǎn)多態(tài)性在ABM發(fā)生上存在交互作用。但同一基因上位點(diǎn)不同，對(duì)不同的環(huán)境因素反應(yīng)也不同。

本研究也存在一定的不足：①本研究應(yīng)進(jìn)一步多中心、擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步證實(shí)；②研究應(yīng)包括更多的LRP5、LRP6基因SNP位點(diǎn)；③影響B(tài)MD降低的機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，在接下來的研究中應(yīng)更多的納入影響B(tài)MD的環(huán)境因素。

當(dāng)前OP的基因治療還多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。主要研究方法是將目的基因轉(zhuǎn)入相應(yīng)器官或組織，然后在體細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)目的基因的表達(dá)，從而觀察骨細(xì)胞及骨小梁的形成。尋找新的基因以及更理想的基因位點(diǎn)是進(jìn)一步研究的重點(diǎn)；而基因治療與傳統(tǒng)治療相結(jié)合也將更加有助于臨床治療。綜上所述，LRP5和LRP6基因有望成為OP基因治療的新靶點(diǎn)。