溫紅珠，戴小玲，林江

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種慢性自身免疫性疾病，以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主要臨床表現(xiàn)；屬于炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)的一種。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人們飲食結(jié)構(gòu)及生活習(xí)慣的改變，UC的發(fā)病率逐年上升。研究者預(yù)測至2025年，中國IBD患者人數(shù)將達到150萬人[1]。UC遷延難愈，世界衛(wèi)生組織將其定為難治性疾病。清腸栓是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院的院內(nèi)制劑，具有清熱除濕，活血化瘀止血的功效，主要由青黛、三七、馬齒莧等藥物組成。前期研究表明清腸栓治療輕中度UC的臨床有效率高達91.49%[2]，最近的機制研究[3]發(fā)現(xiàn)清腸栓治療UC與下調(diào)腸道TLR4表達，抑制NF-κB 活化有關(guān)。本實驗通過葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)造模大鼠糞菌液灌腸以及菌株體外培養(yǎng)的方法，探討清腸栓對于紊亂腸道菌群是否有直接調(diào)節(jié)作用，并探討其與NF-κB通路的關(guān)系。

1 實驗材料

1.1 菌株

兩歧雙歧桿菌(編號：1.5029)和多形擬桿菌(編號：1.5132)，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

1.2 實驗動物

健康雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠24只，4～6周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，合格證編號為SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)實驗動物科部SPF級動物房。

1.3 實驗藥物

DSS購自MP公司，分子質(zhì)量:36 000～50 000，產(chǎn)品貨號:160110。清腸栓組方煎劑主要組成：馬齒莧、五倍子、青黛、三七。由龍華醫(yī)院藥劑科提供，高壓蒸汽滅菌后備用。模型糞菌液：將DSS造模成功大鼠新鮮糞便置于無菌藥碗中，根據(jù)相關(guān)參考文獻[4]按照1∶6(W∶V)的比例加入無菌0.9%生理鹽水進行初步均質(zhì)加工；接著使用無菌壓舌板攪拌5 min后靜置5 min；然后逐級經(jīng)過2層、4層、8層無菌紗布過濾以去除未吸收的食物殘渣和小顆粒物質(zhì)，得到糞菌液，轉(zhuǎn)至-30 ℃保存，1周內(nèi)使用。清腸栓糞菌液：清腸栓組方煎劑高壓蒸汽消毒后使用，將新鮮獲得的DSS造模大鼠糞便按照1∶6(W∶V)比例加入煎劑，攪拌混勻，逐層濾過后，轉(zhuǎn)至-30 ℃保存，1周內(nèi)使用。

1.4 主要試劑及儀器

數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)GBOX/CHEMI-XT4(英國Syngene公司)，包埋機(德國LEICA公司)，自動脫水機(德國LEICA公司)，切片機(德國LEICA公司)，高壓蒸汽滅菌器(日本SANYO公司)，低溫冰箱(日本SANYO公司)，OLYMPUS-ix71顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，伊紅及蘇木素試劑(批號：140410，上海億欣生物科技有限公司)，兔抗β-actin多克隆抗體(批號：#8457，Cell Signal Technology)，兔抗鼠TLR4多克隆抗體(批號：990394W，Bioss公司)，兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(批號：#8242，Cell Signal Technology)。血平板(批號：20200912，上?？岂R嘉生物有限公司)，培養(yǎng)箱(賽默飛二氧化碳培養(yǎng)箱)。

2 實驗方法

2.1 動物分組及模型制備

將24只動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后稱重，根據(jù)體質(zhì)量由小到大編號，采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件，按照動物體質(zhì)量進行隨機分組，將動物分至以下4組：正常組(N)、DSS造模組(M)、模型糞菌液灌腸+DSS造模組(M1)、清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組(M2)。DSS模型制備：稱取適量的DSS加入雙蒸水，搖晃混勻溶解，制成5%(W/V)溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；給予大鼠自由飲用7 d造模，期間禁水不禁食。

2.2 給藥方法

經(jīng)肛灌腸，動物灌腸前12 h禁食不禁水。將大鼠四肢及頭部固定在模板上，使用膠皮管，插入大鼠直腸約5 cm，用注射器緩慢注入37 ℃左右的糞菌液/生理鹽水，灌完后拔出，夾子夾閉大鼠肛門；隨后將大鼠倒置15 min。

2.3 樣本的采集及制備

給予大鼠戊巴比妥鈉(0.5 mL/100 g)腹腔注射深度麻醉后，腹部朝上置于無菌紙上，四肢固定，以75%乙醇擦拭腹部皮毛后自腹中部剪開皮膚，充分暴露腹壁，剪取肛門至回盲部的全部結(jié)腸，首先使用小鑷子分離清除掉結(jié)腸表面的脂肪組織，然后使用小剪刀沿腸系膜邊緣縱行剪開結(jié)腸，多次置于0.9%的冰生理鹽水中涮洗干凈，最后將結(jié)腸平展于濾紙上吸干水分，留取大約2 cm長度的遠端結(jié)腸(組織，輕輕平展于濾紙上，以大頭針固定兩端，置于4%甲醛溶液固定。剩余結(jié)腸置于液氮中速凍后在-80 ℃保存，備Western blot檢測用。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 血平板菌落計數(shù)

3.1.1 兩歧雙歧桿菌計數(shù)

菌株復(fù)蘇后，置于血平板培養(yǎng)48 h；然后分別取2.5%、5%、10%清腸栓組方煎劑、清腸栓組方煎劑原液和純水各10 mL，加入兩歧雙歧桿菌制成含108菌液，使用接種環(huán)在血平板上涂10 μL的菌液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后計數(shù)。隨著煎劑濃度的增加，兩歧雙歧桿菌的菌落數(shù)亦見升高；與純水培養(yǎng)組相比較，清腸栓組方煎劑原液培養(yǎng)組的兩歧雙歧桿菌的菌落數(shù)出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的升高(P<0.01)，見表1。

表1 各濃度清腸栓組方煎液的菌落計數(shù)

3.1.2 多形擬桿菌計數(shù)

菌株復(fù)蘇后，置于血平板培養(yǎng)72 h；然后分別取2.5%、5%、10%清腸栓組方煎劑、清腸栓組方煎劑原液和純水各10 mL，加入多形擬桿菌制成含108的菌液，使用接種環(huán)在血平板上涂10 μL的菌液，置于培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)72 h后計數(shù)。隨著煎劑濃度的增加，多形擬桿菌的菌落數(shù)亦見升高；與純水培養(yǎng)組相比較，清腸栓組方煎劑原液培養(yǎng)組的多形擬桿菌的菌落數(shù)均見具有統(tǒng)計學(xué)意義的升高(P<0.01)，見表2。

表2 各濃度清腸栓組方煎液培養(yǎng)組的菌落計數(shù)

3.2 動物疾病活動指數(shù)

從造模第1天開始，每日觀察并記錄大鼠的毛色、精神狀態(tài)、活動度、糞便性狀、隱血及肉眼血便等情況，按照相關(guān)參考文獻[5]表3進行疾病活動指數(shù)(Disease activity index,DAI)評分，根據(jù)體質(zhì)量下降、糞便性狀及隱血情況評分計算每只大鼠的DAI值，以評估其疾病活動情況。

表3 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

給藥7 d后，與模型糞菌液灌腸+DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組間的DAI評分出現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。與DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組間的DAI評分升高趨勢(P>0.05)，見表4。

表4 各組DSS大鼠DAI評分的比較(分)

3.3 結(jié)腸組織病理學(xué)觀察

制備結(jié)腸組織石蠟切片，進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠結(jié)腸黏膜情況，并參照DIELEMAN等人[6]的組織學(xué)損傷評分(histological index,HI)表評估結(jié)腸損傷情況評分。與DSS造模組相比較，模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分顯著升高(P<0.05)，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分出現(xiàn)下降趨勢(P>0.05)。與模型糞菌液灌腸+DSS造模組相比，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的HI評分顯著下降(P<0.01)，見表5。

表5 各組大鼠HI評分的比較

3.4 結(jié)腸TLR4、NF-κB表達的測定

從各組大鼠結(jié)腸標(biāo)本中隨機選取3個樣本并提取組織總蛋白，采用BCA蛋白定量法測定濃度，制備膠，啟動凝膠電泳(100 V/90 min)轉(zhuǎn)膜后加入一抗、二抗進行孵育，凝膠成像系統(tǒng)顯影，應(yīng)用圖象分析系統(tǒng)分析底片中的目的條帶，計算機自動讀取并記錄每條帶的密度值。與正常組相比較，DSS組、模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結(jié)腸TLR4/NF-kB顯著升高(P<0.01)；與DSS組比較，模型糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結(jié)腸TLR4顯著升高(P<0.05)、NF-kB升高(P>0.05)，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結(jié)腸TLR4/NF-kB下降(P>0.05)；與模型糞菌液灌腸+DSS造模組比較，清腸栓糞菌液灌腸+DSS造模組大鼠的結(jié)腸TLR4/NF-kB顯著下降(P<0.05)，見表6、圖1。

表6 各組DSS大鼠結(jié)腸TLR4、NF-κB的比較

注：N.正常組；D.DSS造模組；M.模型糞菌液+DSS造模組；Q.清腸栓糞菌液+DSS造模組。圖1 各組大鼠結(jié)腸TLR4和NF-kB蛋白表達

4 討論

UC是炎癥性腸病的一種，屬于自身免疫性疾病，其病因復(fù)雜多樣，目前主要認為與免疫、遺傳和環(huán)境等多種因素相關(guān)。UC臨床癥狀以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為主，組織病理學(xué)檢查主要表現(xiàn)為黏膜及黏膜下層炎癥和潰瘍形成。中醫(yī)學(xué)雖然沒有UC病名，但根據(jù)歷代醫(yī)籍中記載的“腸澼”“下利”“久痢”“休息痢”“滯下”等對病名的解釋以及對其臨床表現(xiàn)的描述，我們不難將這些病名與UC聯(lián)系起來。

清腸栓是上世紀(jì)八十年代中期，上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院上海市名老中醫(yī)馬貴同教授在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，結(jié)合多年的臨床與科研經(jīng)驗，針對國人UC發(fā)病的主要病理因素及發(fā)病特征，抓住濕、熱、毒、瘀四個主要病邪，以清熱除濕、活血化瘀為治療法則，同時根據(jù)傳統(tǒng)瘡瘍科制劑的用藥特點，選用青黛、三七、馬齒莧等中藥制成的直腸給藥制劑。方中馬齒莧酸寒無毒，歸肝、大腸經(jīng)，有清熱解毒、除濕止痢、涼血止血之功?！侗静菥V目》記載:“散血消腫，利腸滑胎，解毒通淋”。青黛歸肝、肺、胃經(jīng)，性咸寒，長于清熱解毒，用于清腸胃之邪熱，力專而效宏；《本草正義》有青黛“治瘟疫熱毒發(fā)狂……癰瘍腫毒”的記載。三七甘微苦溫?zé)o毒，善止血活血定痛，祛腐生肌；能通亦能補；具有止血不留瘀血，行血不傷新的優(yōu)點，《本草綱目》記載其能治療“赤痢血痢”。五倍子酸平無毒，歸肺、大腸、腎經(jīng)，澀腸止血，解毒止瀉之功?！侗静菥V目》記載其可療“瀉痢不止”“脾瀉久痢”。全方以馬齒莧、青黛清熱解毒，除濕愈潰，共為君藥；三七活血化瘀、祛腐生肌，并止血而不留瘀，為臣藥；五倍子收斂固澀，助青黛、三七收斂潰瘍瘡口而不留邪，為佐使藥。

腸道菌群是指在人體腸道中與人體共生的微生物，腸道菌群紊亂是近年來有關(guān)UC病因的研究熱點。正常情況下，腸道內(nèi)有大量的免疫細胞，使腸道處于一種“生理性”的慢性炎癥狀態(tài)；UC患者的這種調(diào)控過程出現(xiàn)異常，腸道黏膜免疫功能失調(diào)，這種黏膜免疫系統(tǒng)的慢性激活可能是對某種感染因子的適度反應(yīng)，但至今尚未找到這樣一種感染因子，且UC高發(fā)的國家的感染性腸病的發(fā)病率卻很低。所以，目前主要認為UC的發(fā)病是針對機體腸道菌群的過度免疫應(yīng)答引起的一種病理性炎癥狀態(tài)。腸道菌群在UC中的作用，并不表現(xiàn)為某種特定的腸道微生物引起疾病，而是作為一個整體，通過改變腸道微生態(tài)的穩(wěn)態(tài)參與UC的發(fā)生發(fā)展[7]；有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群參與UC的機制可能與TLR/NF-κB信號通路過度激活有關(guān)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)DSS造模大鼠糞菌結(jié)構(gòu)與正常大鼠不同，這與2012年SAMANTA等人[9]的研究結(jié)果一致。而在DSS造模同時，給予DSS造模動物的糞菌液灌腸可上調(diào)DSS造模大鼠結(jié)腸TLR4、MYD88和NF-κB蛋白表達，這表明腸道菌群紊亂對NF-κB通路過度激活可能確實有促進作用。

兩歧雙歧桿菌和多形擬桿菌均屬于益生菌，研究表明兩歧雙歧桿菌[10]和多形擬桿菌[11]均可誘導(dǎo)DSS結(jié)腸炎緩解，其作用機制與調(diào)節(jié)DSS模型的腸道微生態(tài)失調(diào)，抑制NF-κB信號通路和促炎細胞因子表達等有關(guān)。本研究采用體外研究發(fā)現(xiàn)清腸栓有促進兩歧雙歧桿菌和多形擬桿菌生長的作用。而動物研究發(fā)現(xiàn)與DSS造模+模型糞菌液灌腸組比較，予清腸栓煎劑干預(yù)處理后的模型糞菌液灌腸，則動物的HI評分顯著下降，DAI有下降趨勢。但與DSS造模組相比的HI評分和DAI評分則僅有下降趨勢，表明清腸栓組方治療UC可能與促進了腸道菌群紊亂的恢復(fù)有關(guān)。進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，在DSS造模同時，給予動物模型糞菌液灌腸或清腸栓煎劑干預(yù)處理后的模型糞菌液灌腸，清腸栓糞菌液灌腸組大鼠結(jié)腸組織的TLR4和NF-κB蛋白表達與模型糞菌液灌腸組比較，均出現(xiàn)顯著下降，表明清腸栓可能通過調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，進而抑制NF-κB通路的過度激活，抑制炎癥細胞因子分泌，從而起到治療UC的作用。