張肖靜，馬冰冰，張涵，位登輝，張紅麗，胡浩，趙子睿

（鄭州輕工業(yè)大學(xué)材料與化學(xué)工程學(xué)院，河南鄭州450001）

引 言

厭氧氨氧化是一種新型脫氮工藝，與亞硝化工藝結(jié)合可以在不消耗有機碳源的條件下實現(xiàn)自養(yǎng)脫氮，相比傳統(tǒng)的硝化-反硝化工藝能夠節(jié)省63%的曝氣能耗，而節(jié)省下來的有機物可以轉(zhuǎn)化為能源性氣體甲烷，符合可持續(xù)污水處理的要求[1-3]。厭氧氨氧化工藝的功能微生物是厭氧氨氧化菌（anaerobic ammonium-oxidizing bacteria, AAOB），該類細菌生長緩慢、難以富集，且對環(huán)境條件非常敏感，限制了該工藝的發(fā)展及應(yīng)用[4]。

我國是抗生素生產(chǎn)和使用大國，各級醫(yī)院住院患者抗生素使用率超過70%，遠高于世界衛(wèi)生組織所推薦的使用率（30%），尤其是磺胺類和四環(huán)素類的抗生素，近年來其使用量大幅度增加?？股氐拇罅渴褂脤?dǎo)致其不可避免地進入人類生活的環(huán)境，據(jù)報道，目前已經(jīng)在淡水、土壤、污水廠等環(huán)境中檢測到了抗生素的存在[5-9]。在這兩類抗生素中，以磺胺甲唑（SMX）和土霉素（OTC）為代表，其使用最為廣泛，在多種環(huán)境中被頻繁檢出。例如，在城市污水廠中檢測到了3 μg/L 的SMX[10]，在家禽養(yǎng)殖廢水中檢測到了0～2.3 mg/L 的SMX[11]，而在城市污水廠二沉池出水中SMX 濃度則為115～534 ng/L[12]。同樣，OTC 也在類似環(huán)境中被檢測到，濃度從0.07 ng/L～19.55 mg/L 不等[13-16]。更為重要的是，已有多項研究表明，抗生素對多種污水處理工藝表現(xiàn)出明顯抑制作用，包括硝化反硝化工藝、厭氧氨氧化自養(yǎng)脫氮工藝等[17-19]。例如，Wang 等[20]的研究表明，抗生素的加入降低了微生物群落的多樣性和反硝化菌屬的豐度。Zhang 等[21]研究發(fā)現(xiàn)，當OTC 濃度為40 mg/L 時，厭氧氨氧化菌的相對豐度從16.40%下降到9.35%。當OTC 濃度大于40 mg/L 時，部分微生物死亡，厭氧氨氧化菌的相對豐度下降到4.6%。厭氧氨氧化作為一種最具發(fā)展前景的脫氮工藝，同時也是可持續(xù)污水處理系統(tǒng)的重要組成單元，明確抗生素對其影響機制對于該工藝的發(fā)展應(yīng)用至關(guān)重要[22]。

因此，本文針對應(yīng)用較為廣泛的SMX 和OTC 兩種抗生素，分別考察了其在不同濃度、不同暴露時間下對厭氧氨氧化生物膜活性、胞外聚合物（extracellular polymeric substance，EPS）分泌及功能微生物演替的影響規(guī)律，考慮到SMX 和OTC 在多種環(huán)境中的濃度范圍[15,23]，選擇1～1000 μg/L 的抗生素為本文的研究對象，并重點對兩種抗生素的不同作用進行了對比，以期為厭氧氨氧化處理含抗生素廢水或者應(yīng)用于有抗生素暴露風險的污水處理領(lǐng)域提供一些理論指導(dǎo)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗設(shè)計

采用兩個相同的厭氧氨氧化濾柱，標為1#和2#。濾柱有效體積為2 L，由底部進水，頂部出水，連續(xù)運行。濾柱內(nèi)部以火山巖為填料，火山巖粒徑為6～8 mm，采用人工配水，配水包括50 mg/L 的氨氮，50 mg/L 的亞氮，1000 mg/L的堿度，分別以（NH4）2SO4、NaNO2、NaHCO3配制，同時加以CaCl2、KH2PO4、MgSO4，以及1 ml/L 的微量元素，進水pH 為7.8 左右，HRT 為4 h。將兩個厭氧氨氧化濾柱中的生物膜分別在不同濃度（1、10、100、1000 μg/L）的抗生素中短期暴露（6 h）和長期暴露（22 d）后，測定其微生物活性、EPS和微生物組成。

1.2 活性測定序批實驗

首先，在沒有接觸抗生素時測定兩個生物濾柱中生物膜的活性，作為空白對照。之后依次在不同濃度的抗生素中分別暴露6 h 和22 d 后，再分別測定活性。具體方法為：從火山巖填料上取下約10 mg生物膜，置于10 ml離心管中，采用實驗用水清洗三次之后，再次加入實驗用水至10 ml，放置于恒溫振蕩床上。反應(yīng)溫度為25 ℃，pH 為8.0，反應(yīng)時間為6 h，將反應(yīng)始末的水樣取出測定氨氮、亞氮和硝氮，根據(jù)式（1）計算厭氧氨氧化活性（SAA）。三個離心管同時測定，取平均值。

1.3 EPS和溶解性微生物產(chǎn)物的測定

EPS 提取過程如下[24]：首先取5 ml 生物膜樣品于8000 r/min 離心15 min，取上清液保存待測溶解性微生物產(chǎn)物(SMP)；離心沉淀在磷酸緩沖溶液中再懸浮，40 kHz 超聲處理3 min；混合物在80 ℃水浴中加熱30 min，每10 min 搖勻一次；懸浮液8000 r/min離心15 min，收集上清液進行EPS測定，剩余物質(zhì)測定污泥質(zhì)量。用Folin-phenol 法在500 nm 波長處測定提取液中的蛋白質(zhì)（PRO），用蒽酮法在625 nm 波長處測定提取液中的多糖（PS）。

1.4 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法在410 nm 波長處測定，亞氮采用N-1-萘基乙二胺分光光度法在波長540 nm 處測定，硝氮采用紫外分光光度法在220和275 nm 波長處測定，pH、DO 和溫度采用WTW 多參數(shù)測定儀測定。

1.5 高通量測序

長期暴露在不同濃度的抗生素中后，取生物膜樣品進行高通量測序分析。采用通用引物338F/806R 對16S rRNA 基因V3-V4 區(qū)進行PCR 擴增，利用Illumin公司的Miseq PE300 平臺進行測序。根據(jù)97%的相似度對序列進行OTU 聚類分析。將每條序列與Silva數(shù)據(jù)庫（SSU132）進行比對，得到物種分類。分析計算Shannon、Simpson、ACE、Chao1等多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗生素短期和長期暴露對厭氧氨氧化活性的影響

厭氧氨氧化生物膜分別在不同濃度的兩種抗生素中暴露6 h 和22 d 之后的SAA 如圖1 所示。1#生物膜未暴露在OTC 抗生素中時，其SAA 為14.6 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 的OTC 中暴露6 h 后，再次測定其SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，該結(jié)果與未暴露在OTC 中的SAA 相比變化不大，說明1 μg/L 的OTC 對厭氧氨氧化生物膜的短期影響不大。在10、100、1000 μg/L的OTC中短期暴露后，SAA隨著OTC濃度的增加，逐漸降低為12.2、12.0 和11.6 mg/(h·g SS)。這個結(jié)果說明10 μg/L 的OTC 短期作用對厭氧氨氧化生物膜造成了嚴重的抑制（p＜0.05），而在此基礎(chǔ)上繼續(xù)增加抗生素濃度，雖然依然有抑制，但抑制程度沒有進一步加強。由此可知，OTC 對厭氧氨氧化短期抑制的閾值為10 μg/L。

圖1 在不同抗生素中暴露不同時間后的厭氧氨氧化活性Fig.1 Anammox activity after exposure to different antibiotics for different time

1#厭氧氨氧化濾柱的生物膜長期暴露在1 μg/L的OTC 中22 d 之后，測定其SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，這與短期暴露后的SAA 相同，說明1 μg/L 的OTC 對厭氧氨氧化生物膜的短期作用和長期作用規(guī)律是一致的，均對微生物活性影響不大。而長期暴露在10 μg/L 的OTC 之后，同樣對厭氧氨氧化生物膜表現(xiàn)出了抑制，SAA 降低為13.3 mg/(h·g SS)。值得注意的是，該值高于短期作用后的SAA，推測是在長期暴露過程中，厭氧氨氧化生物膜對OTC 逐漸有了適應(yīng)性，因而生物活性表現(xiàn)出一定的耐受能力。而進一步在100 μg/L 的OTC 中長期暴露后，SAA 不僅沒有降低，反而升高到了15.1 mg/(h·g SS)。這與短期暴露的結(jié)果是不同的，該結(jié)果進一步證明了厭氧氨氧化生物膜長期暴露在OTC 中后表現(xiàn)出了適應(yīng)性，這也可通過2.4 節(jié)的微生物豐度的增加進一步證明。有研究表明，微生物在長期接觸抗生素后可促進抗性基因的富集，通過誘導(dǎo)抗性基因進而對其表現(xiàn)出適應(yīng)性[25-26]。然而，在OTC 增加到1000 μg/L 之后，長期暴露后的SAA 顯著下降，降低到11.1 mg/(h·g SS)（p＜0.05）。這說明此時達到了OTC的抑制閾值，長期抑制閾值為1000 μg/L。

2#厭氧氨氧化濾柱的生物膜在SMX 中短期暴露之前，SAA 為14.5 mg/(h·g SS)，而在1 μg/L 中短期暴露后，SAA 輕微降低為14.3 mg/(h·g SS)，之后在10、100、1000 μg/L 中短期暴露后，SAA 分別降低為13.8、13.7 和13.1 mg/(h·g SS)。在濃度1～1000 μg/L范圍內(nèi)，雖然隨著SMX 的增加，SAA 呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，但整體降低不夠顯著，這說明厭氧氨氧化生物膜對SMX的抵抗性較強。長期暴露在1、10、100、1000 μg/L 的SMX 中后，SAA 分別變化為14.8、14.3、14.1 和13.6 mg/(h·g SS)。1 μg/L 的SMX 導(dǎo)致SAA 輕微增加，由于短期并未產(chǎn)生明顯抑制，因此可能并不存在先抑制后適應(yīng)的過程。有文獻報道，低濃度的有機物有助于厭氧氨氧化的高效穩(wěn)定運行[27]。此外，也有研究表明，低濃度的抗生素不會影響脫氮性能和微生物的活性[28]。因此，這一方面有可能是厭氧氨氧化生物膜對SMX 有較好的抗性，另一方面可能是SMX 誘導(dǎo)了反硝化來提高脫氮性能，該結(jié)果同樣可通過微生物結(jié)果來證明。在隨后增加SMX 濃度后，厭氧氨氧化生物膜活性在長期暴露后均表現(xiàn)出輕微的降低，不同濃度下其SAA 的降低程度與短期暴露后相差不大。這個結(jié)果說明無論是短期作用還是長期作用，1～1000 μg/L 的SMX 對厭氧氨氧化均表現(xiàn)出較小的影響，未帶來明顯的抑制。

2.2 抗生素對胞外聚合物的影響

EPS 是微生物自身分泌并釋放到胞外的聚合物，在抵抗毒性抑制、承受環(huán)境壓力等方面起著重要作用。EPS 的主要成分與微生物細胞非常相似，主要包括PRO和PS兩大類，其主要作用是幫助細胞吸收營養(yǎng)，同時抵御殺菌劑和有毒物質(zhì)對細胞的危害。

從圖2 可知，1#反應(yīng)器的生物膜在1 μg/L 的OTC 中長期暴露后，微生物響應(yīng)較慢，分泌較少的EPS，且蛋白質(zhì)和多糖均顯著下降，這說明微生物在該環(huán)境下能夠正常生長，處于穩(wěn)定生長階段。而在OTC 增加到10 μg/L 以后，EPS 大量增加，尤其是蛋白質(zhì)的變化，從32.6 mg/gSS增加到85.49 mg/gSS，這是微生物受到毒性抑制的表現(xiàn)[29]。當微生物接觸抗生素后，往往會分泌更多的EPS[30-31]。之后隨著OTC濃度的增加，EPS的量再次顯著增加，說明微生物通過分泌大量的EPS 而逐漸適應(yīng)OTC，其活性逐漸得到恢復(fù)。在濃度增加至1000 μg/L時，微生物受到嚴重抑制，大量微生物死亡，其分泌的EPS 也逐漸減少。但值得注意的是，隨著OTC 濃度的增加，SMP的含量逐漸上升，說明有一部分死亡的微生物產(chǎn)物溶解在生物膜中，這部分SMP 被微生物利用進行反硝化，反倒提高了微生物的活性。另外，PRO/PS 的值也逐漸下降，說明分泌的PS 逐漸增多，這也是微生物應(yīng)對毒性的表現(xiàn)。

圖2 在不同抗生素中長期暴露后的EPS和SMP結(jié)果Fig.2 EPS and SMP results after long-term exposure to different antibiotics

在2#反應(yīng)器中，微生物快速響應(yīng)，EPS 在1 μg/L的SMX中即輕微增加，之后則隨著SMX濃度的增高而顯著增加，這說明厭氧氨氧化生物膜對SMX 的響應(yīng)較快，低濃度的SMX 即可刺激EPS 分泌量增加，從而保護厭氧氨氧化微生物免受有毒物質(zhì)的抑制。因而在長期作用過程中，SMX 對SAA 的影響不大。但值得注意的是，SMP 中PRO/PS 的值一直降低，這可能是厭氧氨氧化菌應(yīng)對SMX 的一種策略，通過分泌更多的溶解性多糖，來保護細胞免受傷害，該結(jié)果與OTC 的結(jié)果一致。Wang 等[32]將兩個反應(yīng)器中SMX濃度均控制為1 mg/L，在有EPS保護的情況下，微生物的OUR 值在145 h 后降為95 mg/(L·h)；而在沒有EPS 保護的情況下，微生物的OUR 值則降至10 mg/(L·h)以下。由此可知，微生物接觸SMX 后能夠快速分泌較多的EPS以抵抗毒性抑制。

2.3 優(yōu)勢OTU和微生物多樣性變化

將暴露在不同濃度抗生素的生物膜測序后，得到的多樣性指數(shù)如表1所示。1#濾柱中，Shannon指數(shù)隨著OTC 濃度的增高逐漸增大，說明OTC 的引入帶來了新的微生物種群，使得微生物多樣性增加，也間接說明了此時AAOB 受到其他微生物的影響。然而值得注意的是，在OTC 為100 μg/L 時，Shannon指數(shù)大幅度下降，而此時SAA增加，說明此時AAOB逐漸適應(yīng)了OTC 的存在，活性恢復(fù)，而其他微生物則由于AAOB 的恢復(fù)而降低了活性及增殖，因而表現(xiàn)為多樣性降低。然而在OTC 增加到1000 μg/L 之后，Shannon 指數(shù)再次增加，此時AAOB 再次受到抑制，活性與豐度均下降，其他微生物得以生長，反應(yīng)器的性能與生物多樣性呈現(xiàn)負相關(guān)。2#濾柱中，隨著SMX 濃度的增加，Shannon 指數(shù)逐漸上升后趨于穩(wěn)定，這說明生物膜內(nèi)微生物多樣性上升，同時ACE 指數(shù)逐漸增加，說明優(yōu)勢微生物的豐度在上升。這是因為SMX 已經(jīng)成功誘導(dǎo)了反硝化菌，并與厭氧氨氧化耦合，因而整個過程系統(tǒng)比較穩(wěn)定。Simpson 指數(shù)與Shannon 指數(shù)的變化趨勢剛好相反，反映的規(guī)律一致。

表1 不同生物膜樣品的多樣性指數(shù)和主要功能微生物的相對豐度Table 1 The diversity index of different biofilm samples and the relative abundance of main functional microorganisms

ACE和Chao1指數(shù)分別用來反映優(yōu)勢OTU的豐富度和個數(shù)，其變化規(guī)律基本一致，同樣反映出厭氧氨氧化濾柱在暴露于抗生素后物種種類和豐富度的增加。優(yōu)勢OTU（相對比例＞1%）共分布在七個不同的門，分別是：Planctomycetes、Proteobacteria、Gemmatimonadetes、Petiscibacteria、Acidobacteria、Armatimonadetes 和Deinococcus-Thermus，其生物學(xué)分類及相對豐度見表2和圖3。在這七個門中，相對豐度最高的是Planctomycetes 門，只包含一個OTU，但相對比例達到了17.98%，說明其在厭氧氨氧化生物膜內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢地位。厭氧氨氧化菌屬于Planctomycetes 門，這也證明了即使在長期暴露于抗生素的環(huán)境下，反應(yīng)器依然是以厭氧氨氧化為主的反應(yīng)系統(tǒng)，完成了大部分的脫氮過程。而Proteobacteria 門含有6 個OTU 種類，其中5 個屬于Beta-Proteobacteria， 包括了 Nitrosomonas、Denitritisomas、Acidovorax 等主要的種群。另外幾個門均只包含一個OTU，相對比例較低，再次證明Planctomycetes 和Proteobacteria 在厭氧氨氧化系統(tǒng)的優(yōu)勢地位，這和之前的研究結(jié)果是一致的[33-34]，Beta-proteobacteria 是處理抗生素廢水反應(yīng)器中的主要優(yōu)勢微生物[35]。值得注意的是，在1#生物膜中，除了OTU1 之外，其他OTU 均是在未添加OTC 時最高，之后隨著暴露在OTC 中，其豐度明顯下降。OTU1對應(yīng)的種屬為Candidatus，屬于AAOB菌，這個結(jié)果證明在加入OTC 后，厭氧氨氧化系統(tǒng)發(fā)生了明顯的改變，生物多樣性增加，原有的優(yōu)勢微生物受到抑制，比例下降。而2#生物膜則相反，優(yōu)勢OTU的相對豐度在此后的幾個階段均有所增加，說明其多樣性改變不大，優(yōu)勢微生物沒有發(fā)生改變。這個結(jié)果再次說明了OTC 和SMX 對厭氧氨氧化生物膜作用的不同。

圖3 OTU分類結(jié)果Fig.3 OTU classification results

表2 優(yōu)勢OTU（＞1%）的生物學(xué)分類及相對豐度Table 2 The taxonomic results and relative abundances of the dominated OTU（＞1%）

2.4 脫氮功能微生物的豐度變化

經(jīng)過與Silva 數(shù)據(jù)庫比對，得到不同水平的生物分類。在門分類水平上，Proteobacteria 在兩個濾柱不同階段的所有生物膜中相對豐度均為最大，在1#濾柱的不同階段分別為57.8%、28.5%、41.3%、31.6%、41.1%、在2#濾柱的不同階段分別為31.5%、52.3%、55.9%、51.4%、51.1%。雖然1#生物膜在剛接觸OTC 時，Proteobacteria 豐度急劇減少了29.3%，但隨后能夠逐漸恢復(fù)，并始終保持優(yōu)勢地位。而2#生物膜接觸SMX 后，Proteobacteria 的豐度不僅沒有下降，反而顯著增加，并在不同濃度下保持穩(wěn)定，這也間接反映了2#生物膜在接觸SMX 后的穩(wěn)定性。相對豐度較高的門其次為Planctomycetes，在不同階段分別為19.0%、25.7%、12.3%、41.5%、20.7% 和15.0%、23.5%、17.2%、16.4%、12.6%。多篇文獻報道，這兩個門的微生物廣泛存在于自養(yǎng)脫氮系統(tǒng)[33-34]。生物膜接觸SMX 后，Proteobacteria 的增多有可能使其獲得抗生素耐藥性。關(guān)于抗生素的抵抗機理主要包括誘導(dǎo)可以編碼抗生素改性或者失活的酶，誘導(dǎo)細菌細胞中抗生素靶點的突變，以及位于細菌細胞膜上的泵排出機制等[36-37]?？紤]到厭氧氨氧化對OTC 的自我適應(yīng)，其對于OTC 的抵抗作用有可能是由于泵出機制，而對SMX 則可能是由于降解作用。

屬水平的微生物分類結(jié)果表明，長期暴露在不同濃度不同種類的抗生素中后，厭氧氨氧化生物膜的微生物組成發(fā)生了較大的屬轉(zhuǎn)移。厭氧氨氧化的功能微生物為AAOB，結(jié)合圖4 和表1 可知，屬于AAOB 功能菌的CandidatusKuenenia是1#生物膜中的優(yōu)勢微生物，其相對豐度在不同OTC 濃度下表現(xiàn)出較大的波動，最初接觸OTC 時對AAOB 有刺激強化作用，AAOB 的相對豐度從16.4%增加到23.4%，在OTC 濃度增加為10 μg/L 之后又受到抑制，并在100 μg/L OTC時增強，而在1000 μg/L OTC時再次受到抑制，這與微生物活性的測定結(jié)果表現(xiàn)出良好的正相關(guān)。而在不同濃度的SMX 中暴露的生物膜相對豐度分別為13.85%、20.19%、14.31%、14.15%和9.43%，表現(xiàn)出先增大再減小的趨勢。這說明AAOB對抗生素的響應(yīng)均為：先刺激增強再被抑制。值得注意的是，在接觸抗生素后，兩個反應(yīng)器中均誘導(dǎo)出反硝化菌Denitritisoma，且表現(xiàn)出不同的變化趨勢。1#濾柱中，OTC 對反硝化菌的誘導(dǎo)較慢，僅在OTC達到1000 μg/L時表現(xiàn)出明顯的增殖，相對豐度從0.14%增加到4.2%，而此時AAOB已經(jīng)受到抑制，反硝化菌Denitritisoma的增加有可能是在長期抑制下微生物死亡殘體的分解提供了有機質(zhì)，促進了反硝化反應(yīng)的發(fā)生。不同的是，在2#濾柱中，生物膜一接觸SMX 就立即誘導(dǎo)出反硝化菌，Denitritisoma的相對豐度從0.01%分別增加到3.29%、14.94%、10.43%和13.89%，相對比例較高。反硝化菌可以充分降解SMX 并利用死亡微生物的殘體，因此減輕了SMX 對厭氧氨氧化生物膜的毒性，因而2#濾柱始終處于抑制程度較輕的狀態(tài)。

圖4 屬水平的微生物分類結(jié)果Fig.4 Microbial classification results at the genus level

2.5 SMX和OTC影響微生物活性的機理

通過比較1#和2#生物膜在不同抗生素中分別暴露相同時間后的活性、微生物特征、污泥性能可得知，在短期和長期作用中SMX 對厭氧氨氧化生物膜的影響較小。結(jié)合EPS 的結(jié)果來看，生物膜在接觸低濃度的SMX 后，微生物快速響應(yīng)，分泌出大量的EPS，EPS 可以快速吸附抗生素，阻止其進入細胞內(nèi)部，因而也減輕了其毒性。在后續(xù)不同濃度下，EPS 含量逐漸增多，直到SMX 濃度達到1000 μg/L時，微生物受到抑制，分泌的EPS 不足以抵抗SMX的毒性，因而生物膜活性降低，AAOB 豐度下降。有研究報道，微生物可以通過生長代謝或共代謝的方式對SMX進行轉(zhuǎn)化或部分降解，或者把SMX作為碳源和能源，將其徹底降解或者轉(zhuǎn)化。Wen 等[38]采用A/O-MBR 工藝處理含SMX 的污水，處理系統(tǒng)中SMX 濃度為3 mg/L 時，生物降解作用去除了90.07%的SMX，系統(tǒng)氨氮去除率能夠穩(wěn)定在90%以上。另有研究表明，絕大多數(shù)SMX 降解菌都屬于Proteobacteria 菌門[39]，尤其是革蘭陰性菌對SMX 具有較強的降解能力[40]。而本文測序結(jié)果表明，Proteobacteria 菌門占比相對較高，多種反硝化菌均屬于該菌門，同時厭氧氨氧化系統(tǒng)中主要微生物均為革蘭陰性菌，由此推斷該系統(tǒng)對SMX 有一定的降解作用。而結(jié)合微生物種群的變化可知，厭氧氨氧化生物膜在接觸SMX 后，快速誘導(dǎo)出反硝化菌，且反硝化菌的比例快速增長，并以SMX 為碳源進行反硝化，同時實現(xiàn)了SMX 的降解和進一步脫氮?？傊?，暴露在SMX 中的生物膜，通過快速的EPS 響應(yīng)及相應(yīng)的屬水平轉(zhuǎn)移，能夠適應(yīng)1000 μg/L 以下的SMX。

而暴露在OTC 中的生物膜則表現(xiàn)出不同的性能。厭氧氨氧化生物膜在最初接觸OTC 后，并未受到明顯的影響，這也間接導(dǎo)致微生物沒有快速啟動響應(yīng)機制，相對豐度反而在受到刺激后表現(xiàn)出明顯的增強，從16.4%增加到23.4%。然而，在OTC 的濃度增加到10 μg/L之后，微生物在短期暴露中受到強烈的抑制，活性明顯下降，雖然在長期暴露中有所適應(yīng)，抑制程度減輕，但依然導(dǎo)致了厭氧氨氧化菌的相對豐度降低為10.7%，而此時雖然EPS 大量增加，但并不足以抵抗其抑制。同時此類抗生素能夠特異性地與細菌核糖體30S 亞基的A 位置結(jié)合，阻止氨基酰-tRNA 在該位置上的聯(lián)結(jié)，從而抑制肽鏈的增長和蛋白質(zhì)合成[23,41]，因而導(dǎo)致了較深的抑制程度。研究表明，長期接觸四環(huán)素會抑制氨單加氧酶的合成，使氨氧化過程受到抑制[42]，這有可能是OTC抑制厭氧氨氧化過程的主要原因。此外，反硝化菌在整個過程中沒有得到足夠的誘導(dǎo)，僅在OTC 濃度為1000 μg/L時其相對豐度有明顯的增加，這可能是由于反硝化菌不能快速降解OTC，同時該生物膜內(nèi)并沒有大量產(chǎn)生SMP 供反硝化菌所利用的原因。因此，同樣濃度的OTC 對厭氧氨氧化表現(xiàn)出顯著抑制。

3 結(jié) 論

（1）厭氧氨氧化生物膜在1～1000 μg/L 的OTC和SMX 中短期（6 h）和長期（22 d）暴露結(jié)果表明，OTC 對厭氧氨氧化活性影響較大，且厭氧氨氧化菌對于0～100 μg/L 的OTC 具有適應(yīng)性，而SMX 短期和長期暴露均對厭氧氨氧化無顯著影響。

（2）厭氧氨氧化生物膜對SMX 的響應(yīng)更加快速，可快速增加EPS 的分泌量。EPS 的大量分泌有助于厭氧氨氧化菌抵抗SMX的毒性抑制。

（3）AAOB 相對豐度對抗生素的響應(yīng)為：先受刺激增強再被抑制。SMX 的加入誘導(dǎo)反硝化菌大量增殖，從0.01%最高增加到14.94%，與厭氧氨氧化菌共同完成脫氮并降解SMX，因而SMX 對生物膜脫氮性能影響較小。