黃麗嬋，陳亞軍，雷慶華

廣東省韶關(guān)市婦幼保健院遺傳與產(chǎn)前診斷中心，廣東韶關(guān) 512026

無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(NIPT)是指通過高通量測序技術(shù)(HTS)檢測母體外周血中胎兒游離DNA(cff-DNA)并進行生物信息學(xué)分析，計算出胎兒罹患21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征等染色體疾病的風(fēng)險。1997年，LO等[1]發(fā)現(xiàn)了母體外周血循環(huán)體系中存在cff-DNA小片段，此后大量學(xué)者研究證實了母體中cff-DNA的存在。隨著HTS的靈敏度升高及其在臨床的廣泛應(yīng)用，基于母體外周血檢測胎兒染色體疾病的NIPT成為可能。

近十年來，NIPT由于無創(chuàng)性、高準確性和高靈敏性，得到廣大臨床醫(yī)生和孕婦的認可，被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)前篩查，積累了大量的臨床數(shù)據(jù)。NIPT高風(fēng)險的孕婦需要進行介入性產(chǎn)前診斷、染色體核型G顯帶分析或者同時進行染色體微陣列分析(CMA)。本文回顧性分析2015年1月至2020年12月于本院產(chǎn)前診斷專科門診就診的因NIPT提示高風(fēng)險而接受介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，統(tǒng)計、分析NIPT提示非整倍體數(shù)目異常和其他額外檢測信息異常的檢出情況，通過染色體核型G顯帶分析結(jié)果和CMA結(jié)果驗證，探討該技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2015年1月至2020年12月因NIPT高風(fēng)險接受介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦(本院及外院轉(zhuǎn)診)共126例作為研究對象，年齡21～45歲，孕周16～27周。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象及家屬均簽署知情同意書。

1.2儀器與試劑

1.2.1NIPT DA8600高通量測序儀(中山大學(xué)達安基因股份有限公司)、ABI7500熒光定量PCR儀(美國ABI公司) 、JW-1042R低速冷凍離心機及JW-2017HR高速冷凍離心機(安徽嘉文儀器有限公司)、DNA提取試劑盒(磁珠法，中山大學(xué)達安基因股份有限公司)。

1.2.2染色體核型G顯帶分析 Axio imager Z2染色體全自動掃描儀(德國Zeiss公司)、Ikaros核型分析軟件(德國Metasystems公司)、Class100型CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo fisher scientific公司)、羊水培養(yǎng)基(廣州和能生物有限公司和以色列Biological Industries公司)。

1.2.3CMA CytoScan?750K芯片、GeneChip?洗滌工作站450Dx v.2、GeneChip?雜交爐645、GeneChip?3000 7G 高分辨率掃描儀及自動裝片機(美國Affymetrix公司)、DNA試劑提取盒(德國QIAGEN公司)。

1.3方法

1.3.1NIPT 抽取孕婦外周血10 mL，預(yù)冷低速離心機4 ℃、1 600×g離心10 min，吸取上清血漿，轉(zhuǎn)移至2.0 mL EP管中。預(yù)冷高速離心機，4 ℃，放入上步所得2.0 mL EP管，16 000×g離心10 min，吸取上清血漿，轉(zhuǎn)移至置于2.0 mL EP管中，每管轉(zhuǎn)入750 μL兩次離心后分離血漿，并置于-80 ℃低溫保存。通過血漿分離、cff-DNA提取、DNA測序文庫構(gòu)建、高通量測序模板制備、高通量測序上機測序、生物信息數(shù)據(jù)分析，計算胎兒患21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征、性染色體數(shù)目異常等染色體非整倍體疾病的風(fēng)險概率。結(jié)果判讀：chr21的Z值≥3.000提示胎兒為21-三體綜合征高風(fēng)險；chr18的Z值≥3.000提示胎兒為18-三體綜合征高風(fēng)險；chr13的Z值≥3.000提示胎兒為13-三體綜合征高風(fēng)險；若高通量檢測發(fā)現(xiàn)其他染色體可能存在異常時，其報告形式為附加檢測結(jié)果。

1.3.2染色體核型G顯帶分析 彩超可視下抽取羊水20 mL，分別注入2支無菌管，每管10 mL，均在細胞培養(yǎng)后進行染色體核型G顯帶分析。經(jīng)過細胞培養(yǎng)、換液、傳代、收獲、滴片、染片、Axio imager Z2染色體全自動掃描儀分析，染色體核型診斷參照人類細胞遺傳學(xué)國際命名標準(ISCN2016)[2]。

1.3.3CMA 彩超可視下抽取羊水10 mL注入1支無菌管，直接進行CMA，包括樣本DNA制備、芯片雜交、芯片洗脫和染色、掃描、生物信息數(shù)據(jù)分析。樣本基因組DNA數(shù)據(jù)分析參照OMIM、UCSC、ISCA、DGV、DECIPHER等數(shù)據(jù)庫資料?；蚪MDNA拷貝數(shù)變異(CNVs)的分類參照美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會頒布的應(yīng)用指南(2011年)[3]，分為4類：(1)臨床致病性CNVs；(2)可能臨床致病性CNVs；(3)臨床意義不明CNVs；(4)良性CNVs。

1.4判斷方法 確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)=當年羊水穿刺總例數(shù)/染色體核型G顯帶分析確診的非整倍體胎兒例數(shù)，數(shù)值越高說明進行了不必要介入性羊水穿刺的胎兒例數(shù)越多。嵌合體是指一個生物個體中存在來源于同一合子產(chǎn)生的兩個或多個細胞系現(xiàn)象。嵌合現(xiàn)象可以發(fā)生在常染色體、性染色體上。本文的嵌合體類型主要是數(shù)目異常之間的嵌合。

1.5隨訪 因NIPT高風(fēng)險進行介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦均由本中心產(chǎn)前診斷專業(yè)人員進行電話隨訪，了解新生兒生長發(fā)育情況及健康狀況，并形成記錄。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1NIPT提示高風(fēng)險總體情況 本研究共收集126例因NIPT高風(fēng)險接受介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷的孕婦(本院及外院轉(zhuǎn)診)。NIPT結(jié)果報告范圍為常見的21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征和性染色體非整倍體數(shù)目異常。其中，NIPT非整倍體高風(fēng)險108例包括21-三體綜合征高風(fēng)險62例，18-三體綜合征高風(fēng)險19例，13-三體綜合征高風(fēng)險16例，性染色體數(shù)目異常者11例。額外檢測信息提示其他染色體異常18例，其中染色體缺失8例，染色體重復(fù)10例。

2.2NIPT提示非整倍體高風(fēng)險染色體核型G顯帶分析結(jié)果 NIPT提示非整倍體高風(fēng)險的108例孕婦均進行介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷。羊水細胞染色體核型G顯帶分析培養(yǎng)成功率為100.00%。其中，21-三體綜合征確診53例，陽性符合率為85.48%(53/62)；18-三體綜合征確診13例，陽性符合率為68.42%(13/19)；13-三體綜合征確診5例，陽性符合率為31.25%(5/16)；性染色體數(shù)目異常確診7例，陽性符合率為63.64%(7/11)。各類型陽性符合率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3NIPT提示非整倍體高風(fēng)險例數(shù)增加對確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)的影響 因NIPT提示非整倍體高風(fēng)險進行介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷的例數(shù)從2015年的3例增加到2020年的27例，相反，確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)在下降，從2015年的42下降到2020年的20，減少約50%胎兒不必要進行介入性產(chǎn)前診斷。2015-2020年各年間確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.534,P<0.05)，見表1。

表1 NIPT高風(fēng)險例數(shù)增加對產(chǎn)前診斷非整倍體胎兒穿刺數(shù)的影響

2.4NIPT提示非整倍體高風(fēng)險染色體核型分析的嵌合體情況 2015—2020年NIPT高風(fēng)險孕婦126例，均進行染色體核型G顯帶分析，其中8例確診為嵌合體核型：21-三體綜合征有6例，18-三體綜合征有1例，性染色體非整倍體異常1例，嵌合比例為5.00%～74.65%，見表2。

表2 NIPT高風(fēng)險染色體核型分析的嵌合體情況

2.5NIPT額外檢測信息提示其他染色體異常的產(chǎn)前診斷結(jié)果 NIPT高風(fēng)險孕婦126例，其中18例NIPT額外檢測信息提示其他染色體異常，18例孕婦接受介入性穿刺抽取羊水同時進行染色體核型G顯帶分析和CMA。檢測結(jié)果見表3。

2.6電話隨訪結(jié)果 NIPT結(jié)果提示非整倍體高風(fēng)險孕婦108例，經(jīng)羊水細胞染色體核型G顯帶分析確診78例，全部終止妊娠，30例假陽性胎兒足月分娩，新生兒未見明顯異常。NIPT額外信息提示其他染色體異常18例，經(jīng)CMA檢測驗證，檢測結(jié)果較一致的有5例，陽性符合率為27.78%(5/18)，具體結(jié)果如下：通過羊水細胞染色體G顯帶核型分析和CMA檢測，其中11例胎兒檢測結(jié)果未見明顯異常(不包括編號4胎兒)，11例足月分娩，新生兒未見明顯異常；2例染色體G顯帶核型分析未見異常，CMA檢測出臨床意義不明CNVs，胎兒足月分娩，新生兒未見明顯異常；1例因孕后期發(fā)現(xiàn)彩超異常，明確胎兒預(yù)后不良，終止妊娠；2例檢出致病性CNVs和2例檢出單親二倍體(UPD)，終止妊娠。見表3。

表3 NIPT提示額外檢測信息異常的產(chǎn)前診斷結(jié)果

3 討 論

一直以來，唐氏篩查(孕早期、孕中期)高風(fēng)險孕婦需要進行介入性產(chǎn)前診斷，抽取胎兒(絨毛、羊水、臍血)細胞進行體外培養(yǎng)，并采用細胞遺傳染色體核型G顯帶分析進行診斷。由于唐氏篩查高風(fēng)險假陽性率高，約95%孕婦進行了不必要的穿刺，染色體病發(fā)生率僅為2.14%[4]，一部分健康胎兒因唐氏篩查而丟失，增加了孕婦心理負擔。NIPT具有無創(chuàng)性、高通量、高準確性和高靈敏性，對唐氏綜合征檢出準確性高達99%[5]，孕婦接受度高。

3.1NIPT對非整倍體染色體疾病的檢測效能 本研究共收集NIPT高風(fēng)險孕婦126例，其中有108例提示21-三體綜合征、18-三體綜合征、13-三體綜合征和性染色體數(shù)目異常，全部進行了介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷。羊水細胞染色體核型G顯帶分析提示：21-三體綜合征陽性符合率為85.48%；18-三體綜合征陽性符合率為68.42%；13-三體綜合征陽性符合率為31.25%；性染色體數(shù)目異常陽性符合率為63.64%。各類型的陽性符合率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NIPT出現(xiàn)假陽性的原因可能為雙胎之一死亡、母親染色體異常、限制性胎盤嵌合、胎兒DNA拷貝數(shù)異常、母體血中cff-DNA水平過低、母親罹患腫瘤等[6-8]。

3.2NIPT高風(fēng)險例數(shù)增加與確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)的關(guān)系 本中心李錦昌等[9]報道了NIPT高風(fēng)險孕婦進行介入性產(chǎn)前診斷的數(shù)量增加與確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)間的關(guān)系。經(jīng)過本中心近幾年的數(shù)據(jù)分析，提示NIPT高風(fēng)險例數(shù)增加與確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)關(guān)系密切。由于唐氏篩查假陽性率高，在2015年確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)為42才能診斷出1例非整倍體胎兒，NIPT具有高靈敏度和高準確性，隨著NIPT高風(fēng)險孕婦進入介入性產(chǎn)前診斷的數(shù)量增加，到2020年確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)下降到20就能診斷出1例非整倍體胎兒，避免了近50%胎兒進行介入性產(chǎn)前診斷，降低了胎兒流產(chǎn)風(fēng)險，減輕了孕婦的心理負擔，有效地節(jié)約了醫(yī)療衛(wèi)生資源。

3.3NIPT嵌合體染色體非整倍體疾病的檢測效能 從表2可見，NIPT不僅可以篩查出純合的非整倍體染色體疾病，還可以篩查出不同嵌合比例的非整倍體染色體疾病。嵌合體是在受精卵形成后的胚胎發(fā)育過程有絲分裂中形成的。在個體胚胎發(fā)育過程中，嵌合體形成的時間(早或晚)及部位(分化的器官)不同，嵌合體個體臨床表現(xiàn)差異很大。在126例NIPT高風(fēng)險孕婦中，有8例經(jīng)染色體核型G顯帶分析診斷為嵌合體核型，嵌合比例為5.00%～74.65%，其中21-三體綜合征有6例，18-三體綜合征有1例，性染色體非整倍體異常1例，說明NIPT具有高準確性和高靈敏性，對于不同嵌合比例的嵌合體染色體非整倍體異常具有一定的檢測效能。

3.4NIPT提示額外檢測信息異常的檢測效能 染色體微缺失/微重復(fù)綜合征是由于染色體拷貝數(shù)變異引起的，能引起一系列臨床癥狀的染色體疾病，可以為新發(fā)，也可以從無癥狀或輕中度癥狀父母遺傳而得。有學(xué)者研究報道，染色體微缺失/微重復(fù)在健康人群中的發(fā)生率為0.1%～0.3%[10]。本研究中,NIPT提示額外檢測信息異常與CMA結(jié)果較一致的有5例(表3中胎兒編號5、6、13、14、16)。其陽性符合率為27.78%(5/18)，略低于姜楠等[11]報道的檢測結(jié)果，這可能與本研究NIPT高風(fēng)險孕婦來自不同的實驗室有關(guān)，因不同實驗室NIPT檢測平臺不同，高通量測序深度不一致或生物信息數(shù)據(jù)分析程度不同。

NIPT不僅可以檢測常見非整倍體染色體疾病，還可以檢測出其他染色體異常，包括胎兒CNVs等。但是，不同染色體的陽性符合率不一樣，染色體含有較少基因組信息的陽性符合率較高，本研究中21-三體綜合征陽性符合率達85.48%，13-三體綜合征陽性符合率較低，為31.25%，而胎兒CNVs的陽性符合率為27.78%，與既往研究報道中NIPT胎兒非整倍體陽性符合率和胎兒CNVs陽性符合率基本一致[12-14]。在臨床工作中選擇合適的測序深度，降低NIPT的假陽性率，滿足臨床的需求，還需要進一步探討。

作為無創(chuàng)性篩查技術(shù)，NIPT可以大規(guī)模并行檢測，且檢測時間范圍廣(孕周12～22+6周)，若檢測結(jié)果提示非整倍體高風(fēng)險或額外檢測信息異常時，必須進行介入性羊水穿刺產(chǎn)前診斷。值得注意的是，本研究發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)前篩查引入NIPT，能有效降低確診非整倍體胎兒穿刺數(shù)，提高非整倍體胎兒確診效能。NIPT提示額外檢測信息異常，包括胎兒CNVs，往往會使胎兒發(fā)育出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，通常這些胎兒的結(jié)構(gòu)畸形是在孕中后期三級彩超被發(fā)現(xiàn)。NIPT因其高通量測序，僅需要通過無創(chuàng)性方法抽取母體外周血進行胎兒cff-DNA檢測，若胎兒DNA攜帶有染色體異常，可提前在孕中期發(fā)現(xiàn)，從而進入產(chǎn)前診斷，減少胎兒流產(chǎn)風(fēng)險，減輕孕婦的身體傷害和心理負擔。NIPT非整倍體檢測結(jié)果及額外檢測信息在產(chǎn)前診斷中具備一定的臨床應(yīng)用價值，但篩查結(jié)果提示陽性者必須進行介入性產(chǎn)前診斷，并結(jié)合產(chǎn)前診斷結(jié)果、超聲檢查、電話隨訪等進行全面的遺傳咨詢和風(fēng)險評估。