麥杏連，劉思瑤，肖婷婷，鄧淑妃，何倩君，張中文，溫偉洪，徐令清△

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院/廣東省清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院：1.藥學(xué)部；2.檢驗(yàn)科，廣東清遠(yuǎn) 511518

大腸埃希菌(ECO)屬于革蘭陰性桿菌，是臨床常見(jiàn)條件致病菌之一，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)該菌可引起多種疾病，且該菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，在全世界廣泛流行。產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)微生物首次發(fā)現(xiàn)于人體，后來(lái)人們發(fā)現(xiàn)其也存在于環(huán)境中和動(dòng)物體內(nèi)[1]。臨床治療革蘭陰性菌的首選藥物是碳青霉烯類抗菌藥物，該藥也是抵抗多重耐藥ECO感染的最后一道防線[2]。近年來(lái)，由于抗菌藥物的濫用，導(dǎo)致耐藥基因相互傳播，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌(CRE)逐漸增多，耐藥率明顯升高，院內(nèi)感染率急劇上升[3]。全球感染CRE的大多為成人，兒童患病較少[4]。

多位點(diǎn)序列分型(MLST)是一種標(biāo)準(zhǔn)分子分型技術(shù)[5]，分辨率高、重復(fù)性好，可檢測(cè)多個(gè)管家基因序列獲得基因分型，目前用于細(xì)菌等病原體流行病學(xué)研究。分析結(jié)果用序列分型(ST)表示，不同菌株ST存在差異，遺傳相關(guān)性不同，因此可比較細(xì)菌等位基因多樣性。本研究采用MLST技術(shù)對(duì)本院臨床分離的89株產(chǎn)ESBLs和非產(chǎn)ESBLs ECO進(jìn)行ST，分析耐藥性差異，為院內(nèi)感染防治提供流行病學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 收集本院2018年1—12月ECO 89株，其中產(chǎn)ESBLs 48株，非產(chǎn)ESBLs 41株，剔除重復(fù)菌株。以銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923及ECO ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

1.2儀器與試劑 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF MS，布魯克道爾頓公司)；BD phoenix M50全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀(美國(guó)BD公司)；T 100TMPCR擴(kuò)增儀和電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Gel DoxTMXR+紫外凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)BIO-RAD公司)。頭孢他啶，頭孢他啶/克拉維酸，頭孢噻肟和頭孢噻肟/克拉維酸紙片(英國(guó)Oxoid 公司)；Tiangen 細(xì)菌DNA提取試劑盒，Taq PCR Master Mix、GelRed核酸染料和Marker Ⅱ DNA Ladder(北京天根生化科技有限公司)；哥倫比亞血瓊脂平板(廣州市迪景科技有限公司)；引物(廣州生工生物工程有限公司)。

1.3方法

1.3.1藥敏試驗(yàn)與鑒定 采用BD phoenix M50全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)，質(zhì)譜儀進(jìn)行復(fù)核。

1.3.2ECO DNA提取與MLST 從-80 ℃冰箱取出菌株并復(fù)蘇，轉(zhuǎn)種至血平板，放置孵箱過(guò)夜培養(yǎng)，挑取定量菌落，加入200 μL無(wú)菌生理鹽水制成懸液，按DNA提取試劑盒說(shuō)明書提取DNA，將洗脫后的DNA產(chǎn)物置于1.5 mL無(wú)菌EP管中，置于-80 ℃冰箱保存。7對(duì)管家基因(adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA)按文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)，引物序列及退火溫度見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL：無(wú)菌純水10.5 μL，2 × Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA 1.0 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min；5 ℃變性1 min；退火1 min；72 ℃延伸2 min；30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min。取5.0 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析，5.0 μL 100～1 200 bp Marker Ⅱ DNA Ladder為參照，電壓100 V下電泳10 min然后60 V電泳 40 min，電泳后凝膠系統(tǒng)成像，觀察電泳條帶結(jié)果。PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行純化和測(cè)序。

表1 MLST 7對(duì)管家基因引物序列及退火溫度

1.3.3序列比對(duì)及MLST數(shù)據(jù)分析 將產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果上傳至網(wǎng)站(http://mlst.warwick.ac.uk /mlst/dbs/Ecoli)進(jìn)行分析，獲得對(duì)應(yīng)等位基因號(hào)，基于ECO 7對(duì)管家基因進(jìn)行MLST數(shù)據(jù)分析，獲得對(duì)應(yīng)ST，利用網(wǎng)絡(luò)軟件對(duì)MLST數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1臨床標(biāo)本分布情況 48株產(chǎn)ESBLs菌株：泌尿外科8株，胃腸外科7株，肝膽外科6株，重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)和婦科各5株，其余標(biāo)本來(lái)自其他科室。41株非產(chǎn)ESBLs菌株：泌尿外科12株，肝膽外科8株，其余標(biāo)本來(lái)自其他科室。

2.2藥敏試驗(yàn)與質(zhì)譜鑒定 48株產(chǎn)ESBLs ECO和41株非產(chǎn)ESBLs ECO耐藥率比較結(jié)果見(jiàn)表2，產(chǎn)ESBL ECO對(duì)大部分抗菌藥物的耐藥率顯著高于非產(chǎn)ESBL ECO(P<0.05)。質(zhì)譜結(jié)果與BD phoenix M50全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果完全一致，符合率為100%。

表2 48株產(chǎn)ESBLs和41株非產(chǎn)ESBLs ECO耐藥率比較(%)

2.37對(duì)管家基因PCR擴(kuò)增結(jié)果 對(duì)89株菌株的7對(duì)管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物電泳，結(jié)果顯示，7對(duì)管家基因PCR擴(kuò)增菌株均出現(xiàn)電泳條帶，并與預(yù)期片段長(zhǎng)度583～932 bp相同，見(jiàn)圖1。

注：M為MarkerⅡ DNA Ladder；1～7分別為adk、fumC、icd、purA、gyrB、mdh、recA。

2.4MLST結(jié)果 將89株ECO 7對(duì)管家基因PCR擴(kuò)增后的測(cè)序結(jié)果上傳至網(wǎng)站，與對(duì)應(yīng)的等位基因譜(adk-fumC-gyrB-icd-mdh-purA-recA)比對(duì)得到每個(gè)菌株等位基因號(hào)，并將等位基因號(hào)與對(duì)應(yīng)管家基因進(jìn)行比對(duì)分析。89株ECO共獲得45種ST：產(chǎn)ESBLs ECO 24種，其中ST131型9株，ST1193型6株，其他型別散在分布； 非產(chǎn)ESBLs ECO 21種，其中ST95型7株，ST69型4株，其他型別散在分布。

3 討 論

ECO是目前臨床最常見(jiàn)的條件致病菌之一，近年來(lái)抗菌藥物的濫用導(dǎo)致該菌耐藥率逐年上升，出現(xiàn)多重耐藥和泛耐藥ECO，如產(chǎn)ESBLs ECO。ESBLs對(duì)廣譜頭孢菌素有較強(qiáng)抵抗性，而對(duì)喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物有交叉耐藥性。

MLST是一種具有高分辨率的技術(shù)，通過(guò)測(cè)定細(xì)菌基因組管家基因序列來(lái)比對(duì)基因分型數(shù)據(jù)，屬于分子生物學(xué)方法。與電泳條帶分型方法比較，MLST分析結(jié)果準(zhǔn)確，具有較強(qiáng)的可比性和重復(fù)性，能準(zhǔn)確提供菌株不同型別，用于世界多地區(qū)細(xì)菌分子分型的流行病學(xué)研究。

本研究對(duì)89株ECO進(jìn)行MLST，結(jié)果顯示89株ECO共有45種ST。產(chǎn)ESBLs ECO為24種，主要是ST131型和ST1193型，其他型別散在分布；非產(chǎn)ESBLs ECO為21種，主要是ST69型和ST95型，其他型別散在分布。本研究結(jié)果表明，ST69型、ST95型、ST131型和ST1193型為本院ECO主要型別，而B(niǎo)IRGY等[7]報(bào)道ECO的ST以ST69、ST95、ST131、ST1193、ST38、ST73、ST405、ST12為主。本研究中ST69型占4.5%(4/89，4株全部為非產(chǎn)ESBLs ECO)；ST95型占10.1%(9/89，其中產(chǎn)ESBLs ECO 2株，非產(chǎn)ESBLs ECO 7株)；ST131型占13.5%(12/89,其中產(chǎn)ESBLs ECO 9株，非產(chǎn)ESBLs ECO 3株)；ST1193型占10.1%(9/89，其中產(chǎn)ESBLs ECO 6株，非產(chǎn)ESBLs ECO 3株)。MATSUI等[8]認(rèn)為ST69、ST95、ST1193型是共享基因型，最常見(jiàn)于尿液標(biāo)本分離的ECO，屬于流行性腸外致病ECO譜系。

有研究者對(duì)產(chǎn)ESBLs ECO的ST69型菌株導(dǎo)致的腎盂腎炎進(jìn)行治療，但以失敗告終[9]。ST131型ECO具有毒力因子和高致病性，適應(yīng)力強(qiáng)，與細(xì)菌耐藥有關(guān)。近期有研究在檢測(cè)一位74歲女性患者腸道時(shí)發(fā)現(xiàn)ST131型ECO菌株[10]。ST1193型ECO于2012年在澳大利亞發(fā)現(xiàn)，2013又在法國(guó)一位囊性纖維化患者中發(fā)現(xiàn)[11-12]。ST1193型也是一種新興家族氟喹諾酮耐藥ECO的基因型，在多個(gè)國(guó)家有過(guò)報(bào)道[13-14]。

本研究的ECO菌株分布情況顯示，它們來(lái)自臨床不同科室，型別較散亂，無(wú)法判斷某型別是否為該科室流行菌株，但較多來(lái)自泌尿外科。產(chǎn)ESBLs尿路致病性大腸埃希菌(UPEC)入侵尿道黏膜可導(dǎo)致尿路感染(UTIs)，UTIs在醫(yī)院獲得性感染性疾病中排第2位，僅次于呼吸道感染，可引起嚴(yán)重癥狀，病死率高，是臨床常見(jiàn)感染性疾病之一，給醫(yī)療衛(wèi)生行業(yè)帶來(lái)極大的挑戰(zhàn)。BADER等[15]發(fā)現(xiàn)阿莫西林/克拉維酸可治療尿路感染，能抑制ESBLs，抵抗產(chǎn)ESBLs ECO感染。但阿莫西林/克拉維酸治療產(chǎn)ESBLs ECO引起的感染目前在學(xué)術(shù)界存在爭(zhēng)議，應(yīng)在藥敏試驗(yàn)中檢測(cè)有效后才可用于臨床治療。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，89株ECO中，48株產(chǎn)ESBLs ECO對(duì)頭孢類抗菌藥物耐藥率高，對(duì)酶抑制劑抗菌藥物有較好的敏感率，對(duì)美羅培南、亞胺培南敏感率高。而41株非產(chǎn)ESBLs ECO對(duì)亞胺培南、美羅培南、阿米卡星和頭孢類抗菌藥物有較高的敏感率，可考慮對(duì)感染非產(chǎn)ESBLs ECO患者使用此類藥物治療。

無(wú)論是產(chǎn)ESBLs ECO還是非產(chǎn)ESBLs ECO，都會(huì)給患者帶來(lái)一定危害。在治療方面，產(chǎn)ESBLs ECO感染患者可能要經(jīng)歷更漫長(zhǎng)的治療過(guò)程，而非產(chǎn)ESBLs ECO是引起醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌，同時(shí)也可長(zhǎng)期定植于人體或醫(yī)院環(huán)境中，并通過(guò)不同的感染途徑在院內(nèi)傳播，引起院內(nèi)耐藥株流行及院內(nèi)感染播散。在早期都應(yīng)考慮給予β-內(nèi)酰酶抑制劑及碳青霉烯類抗菌藥物治療，待感染控制后，再進(jìn)行降階治療。為防止出現(xiàn)院內(nèi)感染大暴發(fā)，應(yīng)對(duì)CRE的預(yù)防和控制予以重視，加強(qiáng)易感因素及細(xì)菌耐藥性監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)院內(nèi)各科室的消毒隔離工作及醫(yī)護(hù)人員管理，阻斷一切可能的傳播途徑，切實(shí)控制院內(nèi)感染的發(fā)生和流行。