賴 力，吳貽晨，陳 點(diǎn)，王堯城，劉尚龍

1.福建省立醫(yī)院司法鑒定所/福建省心血管病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350001；2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350001；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建福州 350001

Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(Y-STR)作為一種特殊的遺傳標(biāo)記，在法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親緣鑒定方面具有不可或缺的作用，尤其是在父源關(guān)系鑒定方面，Y-STR基因座分型是判斷不同男性個(gè)體是否來自同一父系的主要依據(jù)。作為人類唯一的單倍體遺傳染色體，Y染色體易發(fā)生染色體內(nèi)非等位性重組，因此Y-STR基因座比常染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)基因座具有較高的變異率。實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，部分Y-STR基因座存在分型缺失(又稱為無效擴(kuò)增)現(xiàn)象，與Y染色體長臂或短臂上部分基因片段的缺失有密切關(guān)系，因此男性不育癥患者的Y染色體無精癥因子區(qū)域(AZF區(qū))微缺失也可能是導(dǎo)致部分Y-STR基因座分型缺失的原因。

本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室日常DNA-STR基因座檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)的Y-STR基因座分型缺失的樣本進(jìn)行Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測(cè)，旨在探討由Y染色體AZF區(qū)微缺失造成的Y-STR基因座分型缺失對(duì)個(gè)體識(shí)別和父源關(guān)系鑒定的影響以及Y-STR基因座作為男性不育癥基因檢測(cè)方法的可行性，并且選擇合適的Y-STR基因座進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和父源關(guān)系鑒定。

1 資料與方法

1.1樣本來源 收集本實(shí)驗(yàn)室日常進(jìn)行個(gè)體識(shí)別以及親緣鑒定DNA-STR基因座檢測(cè)的個(gè)體，每人份采集EDTA抗凝血2 mL，-20 ℃保存。

1.2儀器與試劑 Y-STR基因座分型采用AGCU Y24、GFS 24Y檢測(cè)系統(tǒng)(無錫中德美聯(lián)公司)以及Promega Y23檢測(cè)系統(tǒng)(美國Promega公司)，主要儀器為Veriti擴(kuò)增儀(美國AB公司)和3130型遺傳分析儀(美國AB公司)。Y染色體AZF區(qū)序列標(biāo)簽(STS)位點(diǎn)檢測(cè)使用Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒(熒光PCR-毛細(xì)管電泳法，北京閱微基因技術(shù)公司)，主要儀器為Gen Reader基因分析儀(北京閱微基因技術(shù)公司)。

1.3方法 采用Chelex法提取DNA。Y-STR基因座復(fù)合擴(kuò)增的體系配置和擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)參照各自試劑盒說明書，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離和熒光檢測(cè)在3130型遺傳分析儀上進(jìn)行，采用Data Collection 3.0軟件收集DNA片段的熒光信號(hào)，GeneMapper ID v3.2分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，獲得43個(gè)Y-STR基因座分型結(jié)果。對(duì)存在Y-STR基因座分型缺失的個(gè)體進(jìn)行AZF區(qū)STS位點(diǎn)檢測(cè)，檢測(cè)位點(diǎn)為SRY、ZFY、sY86、sY84、CDY2、SMCY、sY127、sY134、sY1161、sY1191、sY254、sY255、DAZ、sY157、CDY1、ZFX、SMCX、DAZL，反應(yīng)體系20 μL，包含2.5×PCR Mix 8 μL；5×Y-Primer Mix 4 μL；模板DNA 1 μL(8.6 ng/μL)；無核酸酶純水7 μL。PCR擴(kuò)增程序：(1)變性95 ℃，5 min；(2)擴(kuò)增94 ℃，1 min；60 ℃，1 min；72 ℃，1 min 30 s；30個(gè)循環(huán)；(3)延伸60 ℃，60 min；(4)4 ℃或15 ℃低溫保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳檢測(cè)，根據(jù)產(chǎn)物峰面積比例以及缺失情況確定Y染色體微缺失位點(diǎn)。

2 結(jié) 果

本研究共發(fā)現(xiàn)3例樣本存在Y-STR基因座分型缺失現(xiàn)象，其中1例樣本(編號(hào)1)采用GFS 24Y檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)DYS459和DYS527ab基因座分型缺失，用AGCU Y24檢測(cè)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)DYS527ab基因座同樣存在分型缺失(圖1)。進(jìn)一步進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)，結(jié)果顯示該樣本丟失sY255、sY1191、CDY1、sY254和DAZ等STS位點(diǎn)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)該樣本為AZFc區(qū)缺失(b2/b4)，見圖2。

注：A為GFS 24Y檢測(cè)系統(tǒng);B為AGCU Y24檢測(cè)系統(tǒng);畫圈處為分型缺失的基因座;橫軸處方框內(nèi)數(shù)字表示基因座基因型,如DYS446基因座基因型為13，DYS443基因座基因型為13。

本研究還發(fā)現(xiàn)2例存在父子親緣關(guān)系樣本(編號(hào)2、3)的Y-STR基因座分型結(jié)果一致，均存在DYS522、DYS570和DYS576 3個(gè)基因座分型缺失，其余基因座分型為單倍型(圖3)。對(duì)兩份樣本進(jìn)行Y染色體微缺失分析，結(jié)果顯示兩份樣本檢測(cè)結(jié)果一致，AZF區(qū)均未發(fā)現(xiàn)缺失，SRY基因均正常。

注：A為AGCU Y24檢測(cè)系統(tǒng);B為Promega Y23 檢測(cè)系統(tǒng);畫圈處為分型缺失的基因座;橫軸處方框表示基因座基因型,如Y GATA H4基因座基因型為12，DYS447基因座基因型為24。

3 討 論

Y染色體作為男性獨(dú)有的性染色體，具有單倍體父系遺傳的特點(diǎn)。除突變和缺失外，同一家族中所有男性個(gè)體的Y-STR基因座分型結(jié)果理論上應(yīng)完全一致，這也是個(gè)體識(shí)別以及父源關(guān)系鑒定中判斷男性個(gè)體是否來自同一父系的主要手段。Y染色體的非重組區(qū)含有大量高度同源的重復(fù)序列，導(dǎo)致該區(qū)域結(jié)構(gòu)高度不穩(wěn)定，較容易發(fā)生染色體內(nèi)非等位的同源性重組，從而導(dǎo)致Y染色體出現(xiàn)缺失、倒置和重復(fù)等結(jié)構(gòu)異?，F(xiàn)象。多項(xiàng)研究報(bào)道了Y染色體上的遺傳標(biāo)記Y-STR基因座分型缺失現(xiàn)象[1-5]。Y-STR基因座數(shù)據(jù)庫的建立，選擇的檢測(cè)位點(diǎn)數(shù)增多，更有助于發(fā)現(xiàn)分型異常及缺失[6]。

臨床研究表明，位于Y染色體的AZF區(qū)的缺失可能會(huì)導(dǎo)致無精癥或嚴(yán)重少精癥等男性不育癥的發(fā)生。Y染色體AZF區(qū)被劃分為AZFa、AZFb、AZFc 3個(gè)互相間隔的亞區(qū)，不同區(qū)域的AZF區(qū)缺失可對(duì)應(yīng)導(dǎo)致無精癥或嚴(yán)重少精癥等男性不育癥的發(fā)生[7-9]。AZFa區(qū)缺失的患者主要臨床表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征(SCOS)；AZFb區(qū)缺失的患者主要臨床表現(xiàn)為精子成熟過程停滯在精母細(xì)胞，出現(xiàn)成熟障礙；AZFc區(qū)缺失表現(xiàn)為不同程度的精子數(shù)量減少。葉峻杰等[10]研究報(bào)道，在中國漢族男性不育人群中，AZFa、AZFb、AZFbc、AZFc區(qū)缺失的比例分別為5%、5%、15%和75%。本研究發(fā)現(xiàn)1號(hào)樣本也存在AZFc區(qū)缺失，由于樣本來源為未成年人，故無法對(duì)其生育能力進(jìn)行鑒定。

AZF基因位于Y染色體Yq11區(qū)域，目前用于個(gè)體識(shí)別和父源關(guān)系鑒定的部分Y-STR基因座也位于該區(qū)域?，F(xiàn)有研究表明，AZFa區(qū)缺失的患者存在DYS437、DYS389Ⅰ、DYS389Ⅱ、DYS438、DYS439等位點(diǎn)的缺失，AZFb區(qū)缺失的患者存在DYS392、DYS385a/b、DYS549等位點(diǎn)的缺失，AZFc區(qū)缺失的患者存在DYS448、DYS527、DYS459等位點(diǎn)的缺失[11-12]。本研究發(fā)現(xiàn)3例Y-STR基因座分型缺失的個(gè)體，其中1號(hào)樣本發(fā)現(xiàn)DYS459和DYS527ab位點(diǎn)缺失，經(jīng)AZF區(qū)STS位點(diǎn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)存在AZFc區(qū)的缺失，與王躍力等[12]的研究結(jié)果一致，表明上述Y-STR基因座可能位于Y染色體AZF區(qū)，故當(dāng)AZF區(qū)STS位點(diǎn)存在微缺失時(shí)，與STS位點(diǎn)相關(guān)的Y-STR基因座也可能發(fā)生分型缺失。2號(hào)和3號(hào)這2例具有親緣關(guān)系的個(gè)體均發(fā)現(xiàn)DYS522、DYS570和DYS576 3個(gè)Y-STR基因座分型缺失，但AZF區(qū)STS位點(diǎn)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)缺失和異常，表明上述Y-STR基因座的分型缺失不是由AZF區(qū)STS位點(diǎn)微缺失所造成，可能是由Y染色體上其他區(qū)域的染色體片段缺失或者基因座引物結(jié)合區(qū)的堿基序列發(fā)生變異所導(dǎo)致。

鐵展暢等[13]研究報(bào)道，DYS449、DYS458、DYS481、DYS522、DYS570、DYS596、DYS627、DYS576等基因座缺失與位于Yp11.2區(qū)域的Amel-Y片段缺失具有一定相關(guān)性。本研究結(jié)果提示，Y染色體AZF區(qū)各類型STS位點(diǎn)的微缺失會(huì)引起DYS522、DYS570、DYS576、DYS549、DYS527ab等部分Y-STR基因座的分型缺失，說明該部分Y-STR基因座位于Y染色體AZF區(qū)內(nèi)，與男性無精癥或嚴(yán)重少精癥等不育癥具有一定聯(lián)系。因此，在日常鑒定工作中發(fā)現(xiàn)上述Y-STR基因座分型存在部分或全部缺失的個(gè)體可以高度懷疑其AZF區(qū)存在微缺失，可增加Y染色體AZF區(qū)STS位點(diǎn)的檢測(cè)，以發(fā)揮Y-STR基因座作為分子遺傳標(biāo)記物在遺傳疾病檢測(cè)方面的作用。目前該方面的研究較少，有待后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。鑒于部分Y-STR基因座分型會(huì)受到AZF區(qū)微缺失等染色體疾病的影響，故在進(jìn)行個(gè)體識(shí)別和父源關(guān)系鑒定時(shí)，應(yīng)盡可能避免使用易發(fā)生缺失的Y-STR基因座進(jìn)行分型檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備多套檢測(cè)試劑以備復(fù)核。